Matriksin metalloproteaasit suusyövässä

Tutkimuksen tavoitteet ja tärkeimmät tutkimusasetelmat

Selvitimme TAT-2:n roolia pään ja kaulan alueen levyepiteelisyövän leviämisessä sekä analysoimme, aiheuttaako TAT-2-transfektio kielisyöpäsolujen genomissa muutoksia MMP-9:n ja MMP-2:n aktiivisuuteen. Selvitimme, tunkeutuvatko TAT-2-transfektoidut solut kontrollisoluja tehokkaammin. Koemallina käytimme kehittyviä kananalkioita.

Selvitimme kollagenaasien (MMP-1, -8, -13) ja stromelysiini-1:n (MMP-3) aktivoitumisreittiä. Tutkimme, pilkkooko TAT-2 näitä MMP:ja in vitro. Selvitimme myös, vaikuttaako TAT-2-transfektio kielikarsinoomasolujen MMP-1:n, -3:n, -8:n ja -13:n tuotantoon ja aktivaatioon.

Selvitimme avß6 integriinillä transfektoitujen suusyöpäsolujen (VB6) ja kontrollisolujen (C1) MMP-1, -8, -13 ja TIMP-1 mRNA-tuotantoa reaaliaikaisella PCR-tutkimuksella ja proteiinituotantoa Western blotting -menetelmällä. Tutkimme myös, onko solujen välillä eroja tyypin I kollageenin hajottamiskapasiteetissa tai invaasiossa tyypin I kollageenin matriksin tai tyvikalvon eri komponentteja sisältävän matriksin (Matrigel¿) läpi in vitro.

Selvitimme MMP-8:n tuotantoa ja paikallistumista pään ja kaulan alueen levyepiteelisyövissä mRNA- ja proteiinitasolla in vitro ja in vivo. Käytimme RT- ja nested-PCR, in situ -hybridisaatio sekä Western blotting -menetelmiä ja vasta-ainevärjäystä. Lisäksi tutkimme eräiden sytokiinien vaikutusta suusyöpäsolujen MMP-8:n säätelyyn in vitro.

Solukokeilla ja hiirikokeilla tehdyt viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että MMP-8:lla voisi olla sukupuoleen sidottu suojaava vaikutus joissakin epiteliaalisissa syövissä «Balbín M, Fueyo A, Tester AM, Pendas AM, Pitiot AS, Astudillo A, Overall CM, Shapiro SD, Lopez-Otin C. Loss of collagenase-2 confers increased skin tumor susceptibility to male mice. Nat Genet 2003; 3»5, «Montel V, Kleeman J, Agarwal D, Spinella D, Kawai K, Tarin D. Altered metastatic behavior of human breast cancer cells after experimental manip-ulation of matrix metalloproteinase 8 gene expression. C»6. Tutkimme vasta-ainevärjäysten perusteella todetun MMP-8:n määrän korrelaatiota kielisyöpäpotilaiden ennusteeseen (48 naista ja 44 miestä, keski-ikä 62 vuotta, keskimääräinen seuranta-aika 49 kuukautta).

Tulokset

Maligneimmassa solulinjassa TAT-2-transfektio nosti MMP-9:n aktiivisuutta. Muiden solujen MMP-9:n aktivaatioon sillä ei ollut vaikutusta. MMP-2:n aktivaatio ei lisääntynyt millään testatulla solulinjalla. HSC-3 TAT-2-transfektoidut solut tunkeutuivat verisuonten läpi 60 % enemmän kuin kontrollisolut. TAT-2:n ja MMP-9:n vaikutusta tunkeutumiseen vahvisti myös löydös, jossa todettiin TAT-2-spesifisen inhibiittorin, TATI:n, sekä spesifisen gelatinaasi-inhibiittorin kumoavan lisääntyneen invaasion lähes kokonaan.

Puhdistettu TAT-2-proteiini pilkkoi MMP-1:tä, -3:a, -8:aa ja -13:a in vitro olosuhteissa. Entsyymien MMP-1, -8 ja -13 pilkkoutuneilla muodoilla oli kollagenolyyttistä aktiivisuutta in vitro. Kuitenkaan HSC-3 TAT-2-transfektoiduissa soluissa tällaista MMP-1:n, -3:n, -8:n tai -13:n pilkkoutumista aktiivisiksi muodoiksi ei nähty.

MMP-13 mRNA-tuotanto oli merkittävästi vähäisempää VB6-soluissa verrattuna C1-soluihin. Lisäksi käytettäessä integriinin avß6 vasta-ainetta soluviljelykokeissa MMP-13-proteiinituotanto lisääntyi huomattavasti. Solujen välillä ei ollut eroja MMP-1:n, -8:n tai TIMP-1:n tuotannossa. Huomattavaa oli, että VB6 tunkeutui tyypin I kollageenimatriksin läpi samalla tavalla kuin kontrollisolut ja lisäksi VB6- ja C1-soluilta kerätyt viljelynesteet hajottivat tyypin I kollageenia samalla kapasiteetilla.

MMP-8:aa tuotettiin pään ja kaulan alueen levyepiteelisyövissä vähäisiä määriä mRNA- ja proteiinitasoilla potilasnäytteissä ja viljellyissä soluissa. PMA lisäsi MMP-8-proteiinin tuotantoa ja TGF-ß1 vähensi sitä. Kielisyöpänäytteistä 15 % tuotti MMP-8-proteiinia vasta-ainevärjäysten perusteella. Totesimme viitteitä siitä, että MMP-8:n tuotanto kielisyöpää sairastavilla naispotilailla voi liittyä parantuneeseen eloonjäämisennusteeseen (p=0,068). Miespotilailla tällaista ei havaittu (p=0,215).

Johtopäätökset

Tämän tutkimuksen perusteella voidaan päätellä, että TAT-2 voi aktivoida latenttia MMP-9:ää tietyissä solulinjoissa. Vasta-ainevärjäysten perusteella (väitöskirjan tulososiossa) TAT-2:ta tuotetaan suusyövissä in vivo. Puhdistettu TAT-2-proteiini pystyi aktivoimaan myös entsyymit MMP-1, -3, -8 ja -13 in vitro. Kuitenkaan TAT-2-transfektoiduissa kielisyöpäsoluissa tällaista konversiota aktiiviseen muotoon ei nähty. Se, että avß6 integriini vähensi MMP-13:n tuotantoa suusyöpäsoluissa, oli yllättävä löydös. Lisäksi yllättävää oli se, että MMP-13-tuotannon erot eri solulinjojen välillä eivät vaikuttaneet solujen tyypin I kollageenin hajottamiskapasiteettiin tai invaasioon tyypin I kollageenimatriksin läpi. Vaikka MMP-13:sta on vähän tutkimuksia, sitä on pidetty yhtenä merkittävänä MMP:na suusyövän patologiassa «Johansson N, Airola K, Grenman R, Kariniemi AL, Saarialho-Kere U, Kähäri VM. Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinase-13) in squamous cell carcinomas of the head and neck. Am J Pathol 199»7, «Impola U, Uitto VJ, Hietanen J, Häkkinen L, Zhang L, Larjava H, Isaka K, Saarialho-Kere U. Differential expression of matrilysin-1 (MMP-7), 92 kD gelatinase (MMP-9), and metalloelastase (MMP-12) in or»8. Näin ollen tuloksemme poikkeaa aikaisemmista julkaisuista ja voi tuoda uutta näkökulmaa suusyövän patologiaan. Tulos antaa kuitenkin aihetta tutkia edelleen avß6 integriini -välitteistä MMP-13:n säätelyä suusyövissä. Tutkimuksessamme näytimme ensimmäistä kertaa MMP-8:n esiintymisen pään ja kaulan alueen karsinoomissa ja MMP-8:n paikallistumisen syöpäkudoksissa. Tuotetun MMP-8:n määrä oli kuitenkin vähäinen. Kun vertasimme MMP-8:n tuotantoa kielisyöpäpotilaiden ennusteeseen, tulokset olivat samansuuntaisia, kuin viimeaikoina on osoitettu solu- ja hiiritason tutkimuksissa. MMP-8:lla voi olla sukupuoleen sidottu suojaava vaikutus kielisyövässä, mutta tämä havainto vaatii lisätutkimuksia.

Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral carcinomas

Matrix metalloproteinases, MMPs, are a family of enzymes capable of modulating connective tissue components. The expression of several MMPs is increased in oral squamous cell carcinomas (OSCCs). They are assumed to have an important role in the development and progression of OSCCs. However, the exact role and mechanism of the regulation of MMPs in malignant transformation are still largely unknown.

In this study, tumour-associated trypsin-2 (TAT-2) was detected in OSCC tissue sections, and its role in MMP-2 and -9 regulation in carcinoma cells was evaluated. The TAT-2 gene was transfected into two different OSCC cell lines and one immortalized oral epithelial cell line. In TAT-2-transfected cells, MMP-9 activation increased OSCC cell invasion in chicken chorionallantoic membrane assay. Increased intravasation was prevented by tumour-associated trypsin inhibitor or specific gelatinase-inhibiting CTT-peptide. TAT-2 also converted MMP-1, -8, -13 and -3 into smaller molecular weight forms in vitro. However, TAT-2-transfected OSCC cells showed no conversion. TAT-2 was demonstrated to degrade powerfully type I collagen into small fragments in vitro. The cell surface receptor avß6 integrin is strongly up-regulated in OSCCs. By using ß6-transfected OSCC cells, it was demonstrated that avß6 integrin down-regulates MMP-13 expression. However, this integrin did not regulate other collagenases or TIMP-1. ß6-transfected cells invaded more efficiently through the basement membrane matrix, but their migration through type I collagen remained unchanged. MMP-8 expression was detected for the first time in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines and corresponding cultured dermal and tumour fibroblasts. The localization of MMP-8 in HNSCC was determined by immunohistochemical stainings and in situ hybridization. MMP-8 production levels in carcinoma cells were faint and sporadic in HNSCCs sections. Ninety-two primary mobile tongue SCCs were subjected to MMP-8 immunohistochemical staining, and the staining results were compared to survival rates. MMP-8 was associated with improved disease-free survival in females but not in males.

Osajulkaisut

I Nyberg P, Moilanen M, Paju A, Sarin A, Stenman UH, Sorsa T, Salo T. MMP-9 activation by tumor trypsin-2 enhances in vivo invasion of human tongue carcinoma cells. J Dent Res 2002; 81: 831-835.

II Moilanen M, Sorsa T, Stenman M, Nyberg P, Lindy O, Vesterinen J, Paju A, Konttinen YT, Stenman UH, Salo T. Tumor-associated trypsinogen-2 (trypsinogen-2) activates procollagenases (MMP-1, -8, -13) and stromelysin-1 (MMP-3) and degrades type I collagen. Biochemistry 2003; 42: 5414-5420.

III Ylipalosaari M, Thomas GJ, Nyström M, Salhimi S, Marshall JF, Huotari V, Tervahartiala T, Sorsa T, Salo T. avß6 integrin down-regulates the MMP-13 expression in oral squamous cell carcinoma cells. Hyväksytty julkaistavaksi Exp Cell Res.

IV Moilanen M, Pirilä E, Grénman R, Sorsa T, Salo T. Expression and regulation of collagenase-2 (MMP-8) in head and necks cell carcinomas. J Pathol 2002; 197: 72-81.

V Ylipalosaari M, Sorsa T, Thomas G, Tervonen V, Mäklin H, Kantola S, Salo T. Membrane-bound MMP-8 expression is associated with improved cause-specific survival in females but not in males (letter). Käsikirjoitus.

Kiitokset

Kiitän lämpimästi väitöskirjatyötäni taloudellisesti tukeneita tahoja, kuten Suomen Hammaslääkäriseura Apolloniaa, Pohjois-Suomen syöpäyhdistystä ja Suomen Hammaslääkäriseura Apollonian suupatologian jaostoa.