Actinobacillus actinomycetemcomitans patogeeninä ja suun normaaliflooran bakteerina
HLL Laura Lakio väitteli Helsingin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan Hammaslääketieteen laitoksella 10.8.2005 aiheesta "Evolutionary lineages of Actinobacillus actinomycetemcomitans bear diverse traits to support roles as a member of normal flora and as a pathogen". Vastaväittäjänä tilaisuudessa toimi professori Mikael Skurnik ja kustoksena professori Veli-Jukka Uitto, molemmat Helsingin yliopistosta. Työn ovat ohjanneet professori Sirkka Asikainen Uumaja yliopistosta ja dosentti Pirkko Pussinen Helsingin yliopistosta. Työn esitarkastivat tutkimusprofessori Anja Siitonen kansanterveyslaitokselta ja professori Lari Häkkinen University of British Columbiasta, Kanadasta.
Actinobacillus actinomycetemcomitans on gramnegatiivinen, liikkumaton, fakultatiivisesti anaerobinen sauvabakteeri. Se on liitetty erityisesti parodontiitin aggressiivisiin muotoihin, mutta bakteeria löytyy myös parodontaalisesti terveiltä henkilöiltä. A. actinomycetemcomitans on jaettu kuuteen eri serotyyppiin a-f. Serotyyppien esiintymisessä parodontiittipotilaiden ja parodontaalisesti terveiden henkilöiden välillä on eroa. Serotyyppi b esiintyy useammin parodontiittipotilailla, kun taas serotyyppi c esiintyy parodontaalisesti terveillä henkilöillä.
Krooniset infektiot, mukaan lukien hampaitten infektiot kuten parodontiitti, on viime aikoina liitetty lisääntyneeseen riskiin saada sydän- ja verisuonitauti. Mekanismi lisääntyneen riskin taustalla ei ole täysin selvillä, mutta bakteerien tai niiden komponenttien on ajateltu stimuloivan makrofageja verisuonen seinämässä, intimassa, niin että niistä tulee lipiditäytteisiä vaahtosoluja. Vaahtosolujen katsotaan olevan yksi ateroskleroosin tunnusmerkki.
Tutkimuksen tavoitteet ja tärkeimmät tutkimusmenetelmät
Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää A. actinomycetemcomitansin kaksoisroolia suun normaaliflooraan kuuluvana bakteerina sekä parodontiitin patogeeninä. Päähypoteesina oli, että bakteerin patogeenisyydessä on eroja sen eri kehitysopillisten sukulinjojen välillä. Jokainen sukulinja edustavaa A. actinomycetemcomitansin eri serotyyppiä.
A. actinomycetemcomitansin prosentuaalinen osuus ientaskun kokonaisbakteerifloorasta tutkittiin 120 parodontiittipotilaalta. Nämä A. actinomycetemcomitans -kannat serotyypitettiin ja 60 ensimmäistä myös genotyypitettiin käyttäen AP-PCR-menetelmää.
Selvitimme A. actinomycetemcomitansin eri kloonien kykyä luonnolliseen transformaatioon sekä kyvyn mahdollista yhteyttä parodontaalistatukseen. Selvitimme myös A. actinomycetemcomitansin serotyyppi d -spesifisen antigeenin koostumuksen eristämällä antigeenin affiniteettikromatografialla ja karakterisoimalla sen.
Tutkimme A. actinomycetemcomitansin serotyyppien b ja d lipopolysakkaridin (LPS) vaikutusta hiiren vaahtosoluihin in vitro. Makrofagien vaahtosolumuodostus määritettiin kvalitatiivisesti rasvavärjäyksellä ja kvantitatiivisesti radioaktiivisesti leimatun low density -lipoproteiinin (LDL) avulla.
Lisäksi tutkimme makrofageista kahden kolesterolin poistumiseen vaikuttavan reseptorin, ABCA1:n ja SR-B1:n, ekspressiota real time -PCR:n avulla.
Tulokset ja johtopäätökset
A. actinomycetemcomitansin serotyyppiä b esiintyi muita serotyyppejä merkittävästi enemmän parodontiittipotilaiden ientaskussa. Serotyyppiä c puolestaan esiintyi pienempiä osuuksia kuin muita serotyyppejä. Bakteerin kyky luonnolliseen transformaatioon seuraa bakteerin kehitysopillisia päälinjoja, niin että serotyypeillä a, d ja e on kyky luonnolliseen transformaatioon. Luonnollisella transformaatiolla ja parodontaalistatuksella ei tässä tutkimuksessa ollut yhteyttä toisiinsa. Serotyyppi d -spesifinen antigeeni pitää sisällään LPS:n O-antigeenin, ja eristämämme antigeeni oli immunogeeninen kanissa.
Havaitsimme lisäksi, että A. actinomycetemcomitansin LPS aiheuttaa vaahtosolumuodostusta hiiren makrofageissa ja että serotyyppi b näyttäisi indusoivan vaahtosolumuodostusta voimakkaammin kuin serotyyppi d. Lisäksi ABCA1-reseptorin ekspressio väheni enemmän serotyypin b kuin serotyypin d LPS:n vaikutuksesta.
Yhteenveto
A. actinomycetemcomitansin serotyypillä b ja sen tietyillä kloonityypeillä voi olla kyky kasvaa suurina osuuksina ientaskussa, ja tämä kyky voi tehdä näistä kannoista muita kantoja patogeenisempiä. Bakteerin kyky luonnolliseen transformaatioon on voinut vaikuttaa lajin kloonityyppien monimuotoisuuteen, vaikka tietoa ei olekaan, onko kyvystä hyötyä bakteerille. A. actinomycetemcomitansin kloonityypit, joilla on muita tyyppejä parempi kyky aiheuttaa proaterogeenisiä muutoksia hiiren makrofageissa, ovat samoja, jotka ovat muita kloonityyppejä patogeenisempiä myös parodontiitissa. Tutkimus toi lisätietoa A. actinomycetemcomitansin kaksoisroolista suun bakteeriekologiassa ja selvitti bakteerin mahdollista yhteyttä systeemisairauksiin.
Evolutionary lineages of Actinobacillus actinomycetemcomitans bear diverse traits to support roles as a member of normal flora and as a pathogen
The main hypothesis underlying this study was that the pathogenic potential of Actinobacillus actinomycetemcomitans, which is recognized as a periodontal pathogen but also as a part of the normal oral flora, differs among its evolutionary lineages. It was also hypothesized that certain clonal types of A. actinomycetemcomitans possess enhanced capacity to induce atherogenesis.
The clonal types of A. actinomycetemcomitans strains from patients with periodontitis were serotyped by immunodiffusion and genotyped by AP-PCR. The ability for natural transformation of a clone was detected by adding donor DNA to the recipient cells and cultivating the cells on a selective medium.
The serotype-specific antigen was isolated by affinity chromatography, characterized by silver staining, Western blots and displacement-ELISA, and used in rabbit immunization. A. actinomycetemcomitans LPS–induced proatherogenic changes in macrophages were studied in the presence and absence of LDL. The accumulation of LDL in the cells was detected by radioactivelly labelled LDL. Cytokine (IL-1 beta and TNF-alpha) expression was measured by commercial kits. The mRNA expression of the ABCA1 and SR-B1 on the macrophage surface was analyzed by real-time PCR.
The results indicated that in inflamed periodontium, A. actinomycetemcomitans serotype b could be cultured in elevated proportions of subgingival flora significantly more frequently than the other serotypes. Among different A. actinomycetemcomitans strains the natural ability to transform was dependent on serotype. The serotype d -specific antigen contained LPS O-antigen and was immunogenic. Experiments conducted to compare the differences in biological effects of LPS between serotypes b (JP2 and Y4) and d (IDH781) showed that JP2-LPS induced formation of macrophage-derived foam cells and decreased ABCA1 mRNA expression significantly more efficiently than IDH781-LPS did. Serotype b LPS induced TNF-alfa production by macrophages significantly more than serotype d LPS did.
In conclusion, in the subgingival flora of patients with periodontitis, the proportions of A. actinomycetemcomitans serotype b may be elevated. The ability to induce/promote systemic pathogenesis may differ between LPSs isolated from different clones of A. actinomycetemcomitans, and the clones with high proatherogenic potential seem to be the same as those associated with periodontitis.
Osajulkaisut
I. Lakio L, Kuula H, Dogan B, Asikainen S. Actinobacillus actinomycetemcomitans proportions of subgingival bacterial flora in relation to its clonal type. Eur J Oral Sci 2002; 110: 212-217.
II. Fujise O, Lakio L, Wang Y, Asikainen S, Chen C. Clonal distribution of natural competence in Actinobacillus actinomycetemcomitans. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 340-342.
III. Lakio L, Paju S, Alfthan G, Tiirola T, Asikainen S, Pussinen PJ. Actinobacillus actinomycetemcomitans serotype d -specific antigen contains the O antigen of lipopolysaccharide. Infect Immun 2003; 71: 5005-5011.
IV. Lakio L, Lehto M, Tuomainen AM, Jauhiainen M, Malle E, Asikainen S, Pussinen PJ. Proatherogenic properties of lipopolysaccharide from periodontal pathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Endotoxin Res. In press.
Kiitokset
Kiitän lämpimästi Suomen Hammaslääkäriseura Apolloniaa ja Suomen Kulttuurirahastoa saamastani taloudellisesta tuesta tutkimukselleni
leukkone@mappi.helsinki.fi