Matriksin metalloproteinaasit terveiden ja reikiintyneiden hampaiden pulpa-dentiinikompleksissa
HLL Merja Sulkalan väitöskirja "Matrix metalloproteinases (MMPs) in the dentin-pulp complex of healthy and carious teeth" tarkastettiin Oulun yliopistossa 10. joulukuuta 2004. Väitöskirjatyön ohjasivat dosentti Leo Tjäderhane Helsingin yliopistosta sekä professorit Tuula Salo ja Markku Larmas Oulun yliopistosta. Työn esitarkastivat dosentti Pirjo-Liisa Lukinmaa ja professori Veli-Jukka Uitto Helsingin yliopistosta. Vastaväittäjänä tilaisuudessa toimi professori Henry Magloire Lyonin yliopistosta Ranskasta ja kustoksena dosentti Leo Tjäderhane.
Karieksen edetessä dentiinissä mineraalit liukenevat ja näin paljastunut pääosin tyypin I kollageenista muodostunut orgaaninen soluväliaine eli matriksi hajoaa. Orgaaninen matriksi on hyvin vastustuskykyinen mm. hapoille, ja sen hajottaminen tapahtuukin entsymaattisilla prosesseilla, jotka tunnetaan kuitenkin huonosti.
Yhteensä 23 jäsentä sisältävä matriksin metalloproteinaasi (MMP) -entsyymiperhe on ihmisen tärkein soluväliainetta hajottava entsyymiryhmä, johon kuuluu mm. useita säikeisiä kollageeneja pilkkovia entsyymejä. Niillä on tärkeitä tehtäviä elimistön fysiologisessa uudelleenmuokkaamisessa ja kehityksessä. MMP:ja esiintyy normaalisti myös hampaan pulpa-dentiinikompleksissa, ja ne osallistuvat mm. hammasluun muodostukseen ja pulpakudoksen soluväliaineen uudelleenmuokkaukseen. Aikaisemmissa tutkimuksissa MMP:ja on löydetty myös karioituneesta dentiinistä, ja ainakin osa niistä aktivoituu pH-vaihtelulla happamasta takaisin neutraaliin, siis fermentoituvien hiilihydraattien nauttimisen jälkeen kariesleesiossa havaittavan pH-vaihtelun seurauksena. Näin ollen MMP:ien on ehdotettu osallistuvan orgaanisen aineen hajottamiseen dentiinikarieksen etenemisen aikana. MMP-aktiivisuuden on esitetty myös lisääntyvän pulpa-dentiinikompleksin soluissa käynnistyvissä puolustusreaktioissa kariesta vastaan, kuten tertiääri- ja intratubulaarisen dentiinin muodostuksen aikana.
Tutkimuksen tavoitteet, aineisto ja menetelmät
Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää matriksin metalloproteinaasien mahdollista roolia dentiinikarieksen etenemisessä in vivo -kokeella, jossa tutkittiin kahden synteettisen MMP-estäjän, kemiallisesti modifioidun tetrasykliini-3:n (CMT-3) ja bisfosfonaatteihin kuuluvan zoledronaatin vaikutusta rottien alaposkihampaiden dentiinikarieksen pinta-alaan. Tavoitteena oli myös selvittää mahdollisia muutoksia pulpa-dentiinikompleksin pehmytkudosten MMP:ien ilmentymisessä karieksen aikana sekä karioituneen dentiinin sisältämien MMP:ien alkuperää. Näin ollen tutkittiin MMP:ien ilmentymistä ja esiintymistä ihmisen odontoblasteissa, pulpakudoksessa sekä mineralisoituneessa dentiinissä. Odontoblastien ja pulpan MMP-geeniekspression tutkimisessa käytettiin cDNA microarray -menetelmää ja MMP-13-geeniekspression selvittämiseksi lisäksi kvantitatiivista PCR (polymerase chain reaction) -menetelmää. MMP-proteiinien tunnistamisessa ja paikantamisessa käytettiin Western blot ja gelatiinizymografia -menetelmiä, immunohistokemiallisia värjäyksiä sekä MMP-8:n tunnistamiseksi immunofluorometrista määritystä. MMP-proteiinien aktiivisuutta mitattiin in vitro -testeillä, joissa substraatteina käytettiin natiivia ja denaturoitua tyypin I kollageenia.
Tulokset ja johtopäätökset
MMP-estäjien todettiin vähentävän rottien alaposkihampaiden dentiinikarieksen pinta-alaa, mikä viittaa isäntäperäisten MMP:ien myötävaikuttavan dentiinikarieksen etenemiseen.
Tutkimuksessa saatiin selville normaaleissa aikuisen ihmisen kudoksissa harvinaisen MMP:n, MMP-13:n, ilmentyminen lähetti-RNA- ja proteiinitasolla kypsän hampaan pulpakudoksessa. Samoin osoitettiin kiilteen kehitykseen olennaisesti liittyvän MMP-20:n ilmentyminen myös kypsien hampaiden odontoblasteissa ja pulpassa. Tutkimuksen perusteella varhainen, joko kiilteeseen tai dentiinin pinnallisimpiin osiin ulottuva karies ei aiheuta merkittäviä muutoksia pulpan MMP-geenien ilmentymisessä tai odonto-blastien ja pulpan MMP-13 ja MMP-20 -synteesissä käytettäessä tutkimusmateriaalina yhdistettyjä kudosnäytteitä. Kuitenkin jatkotutkimukset yksittäisten hampaiden kudosnäytteistä olisivat tulevaisuudessa hyödyllisiä, sillä ainakin MMP-13:n ilmentymisessä havaittiin suuria eroja yksittäisten terveiden ja reikiintyneiden hampaiden kudosten välillä.
Tutkimuksessa osoitettiin kahta aiemmin ihmisen mineralisoituneessa dentiinissä tunnistamatonta MMP:ia, MMP-20:tä sekä kollagenaasi-2:ta (MMP-8). Dentiiniin sen kehityksen aikana sitoutuneet MMP:it vapautuivat siitä dentiinin demineralisoituessa ja orgaanisen matriksin paljastuessa, ja vapautuneet MMP:it kykenivät myös hajottamaan sekä natiivia että denaturoitua kollageenia. Näin ollen dentiinin MMP:eilla saattaa olla merkitystä dentiinikarieksen patogeneesissä.
Matrix metalloproteinases (MMPs) in the dentin-pulp complex of healthy and carious teeth
During the progression of dentin caries, the collagenous organic matrix is degraded, but the exact mechanisms and enzymes responsible for the breakdown of this matrix remain largely unknown. Matrix metalloproteinases (MMPs), a family of endopeptidases capable of degrading virtually all extracellular matrix components in concert, are expressed during normal formation and maintenance of the dentin-pulp complex. Their activity has also been suggested to contribute to degradation of the organic matrix during the progression of dentin caries and to the repair and defence reactions elicited by caries in cells of the dentin-pulp complex.
The aim of this study was to further elucidate the role of host MMPs in the progression of dentin caries and the origin of MMPs in carious dentin as well as possible changes in MMP expression in the cells of this complex in response to caries. MMP-inhibitors decreased progression of dentin caries in vivo, thus suggesting involvement of host MMPs in dentin pathogenesis. When MMP gene expression was examined over a wide scale by cDNA microarray, pooled pulp samples demonstrated a high level of MMP-13 expression, which is rare among normal human adult tissues, but failed to show any marked changes in MMP expression due to caries. The protein expression of MMP-13 was detected in pulp and odontoblasts with no significant differences between the tissues of sound and carious teeth. This was also the case with MMP-20 (enamelysin) protein, which was demonstrated for the first time in mature human odonto-blasts and pulp tissue. MMP-20, MMP-8 and gelatinases were demonstrated in mature human dentin; and when released, these dentinal MMPs exhibited activity against native and denatured type I collagen.
Kiitokset
Kiitän lämpimästi Suomen hammaslääkäriseura Apolloniaa ja Oulun yliopistoa saamastani taloudellisesta tuesta tutkimukselle.
Osajulkaisut:
I Sulkala M, Wahlgren J, Larmas M, Sorsa T, Teronen O, Salo T, Tjäderhane L. The effects of MMP inhibitors on human salivary MMP activity and caries progression in rats. J Dent Res 2001; 80: 1545-1549.
II Sulkala M, Pääkkönen V, Larmas M, Salo T, Tjäderhane L. Matrix metalloproteinase-13 (MMP-13, collagenase-3) is highly expressed in human tooth pulp. Connect Tissue Res 2004, in press.
III Sulkala M, Larmas M, Sorsa T, Salo T, Tjäderhane L. The localization of matrix metalloproteinase-20 (MMP-20, enamelysin) in mature human teeth. J Dent Res 2002; 81: 603-607.
IV Sulkala M, Tervahartiala T, Sorsa T, Larmas M, Salo T, Tjäderhane L. Collagenases and gelatinases in human dentin. Käsikirjoitus.
merja.sulkala@oulu.fi