Passiivinen kariesimmunisaatio

Karies ja Streptococcus mutans

Karieksen pääasiallinen aiheuttaja on S. mutans -bakteeri «Loesche WJ. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev 1986; 50: 2594-2600. »7. Keskeistä S. mutansin kolonisaation ymmärtämisessä on se, kuinka bakteerin pinnan molekyylikomponentit toimivat yhdessä hampaan pellikkelin kanssa. DNA:n ominaisuuksien perusteella mutans-streptokokit jaetaan seitsemään eri lajiin. Kukin laji voidaan vuorostaan jakaa kahdeksaan eri serotyyppiin. S. mutansin genomi on hiljattain sekvensoitu ja sen on osoitettu muodostuvan 2 030 936 emäsparista «Adjic D, McShan WM, McLaughlin RE, Savic G, Chang J, Carson MB, et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. PNAS 2002; 99: 14434-14439. »8. Tämän lisäksi genomin rakenne ja sen analysointi voivat tulevaisuudessa antaa tutkijoille arvokasta tietoa siitä, kuinka S. mutans on sopeutunut selviytymään suun olosuhteissa.

S. mutansin pinnassa on tiettyjä rakenteita (esim. serotyypille ominaiset polysakkaridit, glukosyylitransferaasit Gtfs), glukaania sitovia proteiineja (GBP) ja pinta-adheesioproteiineja SAI/II (adheesioproteiinia I/II kutsutaan myös nimellä Ag I/II, antigeeni I/II) «Koga T, Yamashita Y, Nakano Y, Kawasaki M, Oho T, Yu H, Nakai M, Okahashi N. Surface proteins of Streptococcus mutans. Dev Biol Stand 1995; 85: 363-369. »9, «Kuramitsu HK. Virulence factors of mutans streptococci: role of molecular genetics. Crit Rev Oral Biol Med 1993; 4: 159-176. »10. Solun pinnan molekyyleillä on tärkeä rooli bakteerin ja sen isäntäorganismin vuorovaikutuksessa ja siksi ne ovat olleet esillä mahdollisina rokotekandidaatteina. Nämä taudinaiheuttajatekijät vaikuttavat voimakkaasti S. mutansin kykyyn sitoutua pellikkeliin ja selviytyä ravinnottomista ja hapottomista jaksoista.

Pinta-adheesiomolekyyli SAI/II on solun pintaan kiinnittynyt adhesiini, joka on mukana S. mutansin tarttumisessa pellikkelin sylkiagglutiniinireseptoreihin (reseptorit, jotka pystyvät sitomaan bakteereita toisiinsa). Pinta-adheesiomolekyyli SAI/II:n katsotaan olevan tärkeä S. mutansin kolonisaatiossa suuhun «Kelly CG, Evans P, Bergmeier L, Lee SF, Progulske-Fox A, Harris AC, et al. Sequence analysis of the cloned streptococcal antigen I/II. FEBS Lett 1989; 258: 127-132. »11. (Proteiinia on kutsuttu myös nimillä AgI/II, B, IF, P1, SR, MSL-1 ja PAC «Koga T, Yamashita Y, Nakano Y, Kawasaki M, Oho T, Yu H, Nakai M, Okahashi N. Surface proteins of Streptococcus mutans. Dev Biol Stand 1995; 85: 363-369. »9.) SAI/II:ta on pitkään pidetty yhtenä tärkeimmistä S. mutansin antigeeneistä ja merkittävänä virulenssitekijänä. Suuri osa tähän mennessä julkaistuista aktiivista ja passiivista kariesimmunisaatiota käsittelevistä tutkimuksista käsittelee SAI/II:een kohdistettuja vasta-aineita.

Vielä tärkeämpi virulenssitekijä S. mutansin kolonisaatiokyvyssä ovat glukosyylitransferaasit, jotka ovat solun pintaan kiinnittyneitä entsyymejä tai pikemminkin entsyymiryhmiä, jotka vastaavat glukaanin tuotannosta. Glukaani on solunulkoinen polysakkaridi, jota S. mutans tuottaa glukoosista. Mutans-streptokokit käyttävät glukaania energianlähteenä silloin, kun ravinnosta on puutetta, ja liima-aineena sileällä hampaan pinnalla «Tanzer JM. Essential dependence of smooth surface caries on, and augmentation of fissure caries by sucrose and Streptococcus mutans infection. Infect Immun 1979; 25: 526-531. »12. Glukaania on syljessä ja hampaan pinnan pellikkelissä. Se voi vaikuttaa mutans-streptokokkien valikoivaan tarttumiseen ja olla tärkeä tekijä plakin muodostumisessa «Vacca-Smith AM, Venkitaraman AR, Quivey RG, Bowen WH. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with (-amylase and starch on the surface of saliva coated hydroxyapatite. Arch Oral Biol 1996; »13. Glukosyylitransferaasit ovat erittäin tärkeä virulenssitekijä S. mutansin hampaan pinnalla selviytymisen ja kolonisoitumisen kannalta.

Karies ja laktobasillit

Laktobasillit ovat grampositiivisia bakteereja, joita on vuosisatojen ajan käytetty ruoan säilytyksessä ja käymisreaktioissa. Tietyt laktobasillikannat ovat osa mahasuolikanavan normaaliflooraa «Ahrne S, Nobaek S, Jeppsson B, Adlerberth I, Wold AE, Molin G. The normal Lactobacillus flora of healthy human rectal and oral mucosa. J Appl Microbiol 1998; 85: 88-94. »14. Laktobasillit luokitellaan ns. GRAS-organismeihin (Generally regarded as safe) eivätkä ne aiheuta sairauksia. Nykyään laktobasilleja on esimerkiksi nk. funktionaalisissa elintarvikkeissa (esim. jogurtti). Useimmat tutkijat ovat sitä mieltä, että laktobasilleilla voidaan ehkäistä infektioita, kuten ripulia ja tulehduksellisia suolisairauksia «Shornikova AV, Casas IA, Isolauri I, Mykkänen H, Vesikari T. Lactobacillus rhamnosus as a therapeutic agent in acute diarrhea in young children. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1997; 24: 399-404. »15.

Suun laktobasilleilla on pitkään katsottu olevan yhteys kariekseen, koska niitä on havaittu karioituneessa dentiinissä ja koska ne tuottavat maitohappoa, joka voi nopeuttaa karieksen etenemistä. Hiljattain tehdyssä tutkimuksessa huomattiin, että kariesvapailta ja kariesaktiivisilta otetut laktobasillit erosivat toisistaan merkittävästi. Kariesaktiivisilla potilailla laktobasillit kiinnittyivät helpommin kosteille pinnoille ja tuottivat vähemmän aineita, joilla on ehkäisevä vaikutus muiden mikrobien kasvuun «Ahumada Mdel C, Bru E, Colloca ME, Lopez ME, Nader-Macias MD. Evaluation and comparison of lactobacilli characteristics in the mouths of patients with or without cavities. J Oral Sci 2003; 45: 1-9. »16. Kasvualustalla S. mutans ei voi kasvaa Lactobacillus paracasein (L. paracasei) läheisyydessä, vaan laktobasillien ympärille muodostuu kirkas vyöhyke «»1 «Krüger C, Hultberg A, Marcotte H, Ma JK, Hammarström L. Passive immunization by lactobacilli expressing single-chain antibodies against Streptococcus mutans. 2005 (Submitted). »17. Mielenkiintoa on herättänyt myös Lactobacillus rhamnosus GG:n (LGG) kyky tuottaa muutamien bakteerien (mukaan lukien Streptococcus-alalajit) aktiviteettia ehkäiseviä tekijöitä «Silva M, Jacobus NV, Deneke C, Gorbach SL. Antimicrobial substance from human Lactobacillus strain. Antimicrob Agents Chemother 1987; 31: 1231-1233. »18. Molempien em. laktobasillien ja LGG:n katsotaan kilpailevan streptokokkien kanssa niin kutsutuista adheesiopaikoista suussa. Laboratorio-olosuhteissa on osoitettu, että LGG pystyy tilapäisesti kolonisoitumaan suuhun ja siten heikentämään S. sobrinuksen kasvua «Meurman JH, Antila H, Korhonen A, Salminen S. Effect of Lactobacillus rhamnosus strain GG (ATCC 53103) on the growth of Streptococcus sobrinus in vitro. Eur J Oral Sci 1995; 103: 253-258. »19. Ihmisestä eristetyt laktobasillit pystyvät ehkäisemään myös S. mutansin glukaanituotantoa «Chung J, Ha ES, Park HR, Kim S. Isolation and characterization of Lactobacillus species inhibiting the formation of Streptococcus mutans biofilm. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 214-216. »20. Suomalaisessa tutkimuksessa päiväkotilapset saivat seitsemän kuukauden ajan LGG:ta sisältävää maitoa. Tulokset osoittivat, että LGG:ta saaneilla lapsilla oli tutkimuksen lopussa vähemmän kariesta ja S. mutansia «Näse L, Hatakka K, Savilahti E, Saxelin M, Ponka A, Poussa T, et al. Effect of long-term consumption of a probiotic bacterium, Lactobacillus rhamnosus GG, in milk on dental caries and caries risk in c»21.

Laktobasillit ovat suuri, heterogeeninen bakteeriryhmä, jota täytyy arvioida myös kariologisesta näkökulmasta. On osoittautunut, että laktobasilleja voitaisiin käyttää probioottina kariesta vastaan ja tulevaisuudessa myös muita suusairauksia vastaan. Karieksen välttämiseksi on tärkeää käyttää vähemmän happoa tuottavaa laktobasillikantaa. Laktobasillien kyky tuottaa bakteereja estäviä aineita (nk. bakteriosiineja) on hyvin mielenkiintoinen tutkimuskenttä, ja niiden kyky kolonisoitua suuhun tekee niistä täydellisiä rokotteen kantajia.

Naudasta peräisin olevat vasta-aineet

Naudasta peräisin olevat vasta-aineet siirtyvät aktiivisessa kuljetuksessa plasmasta lehmänmaitoon ja niiden konsentraatio on suuri ternimaidossa «Weiner C, Pan Q, Hurtig M, Borén T, Bostwick E, Hammarström L. Passive immunity against human pathogens using bovine antibodies. Clin Exp Immunol 1999; 116: 193-205. »3. Lehmän ternimaidossa voi olla vasta-ainetta 40-200 mg/ml ja sitä on käytetty passiivisessa immunisaatiossa joitakin maha-suolikanavan patogeenejä (mm. S. mutansia) vastaan. Lehmä immunisoidaan antigeenillä, ja odotetaan immuunivastetta. Sitten lypsetään ternimaito, jossa on runsaasti vasta-ainetta. Ensimmäisissä 5-6 lypsyssä vasta-ainemäärät ovat suurimmat. Menetelmä voidaan toistaa useita kertoja samalla lehmällä, mutta vasta-aineiden puhdistaminen on edelleen työlästä ja kallista.

Michalek työryhmineen osoitti tutkimuksissaan, kuinka rotille, joiden ravintoon lisättiin kokonaisilla S. mutans -bakteereilla immunisoitujen lehmien heraa, tuli vähemmän kariesta «Michalek SM, Gregory RL, Harmon CC, Katz J, Richardson GJ, Hilton T, et al. Protection of gnotobiotic rats against dental caries by passive immunization with bovine milk antibodies to Streptococcus mu»22. On osoitettu myös sekä S. mutansilla että S. sobrinuksella immunisoitujen lehmien ternimaidon ehkäisevän glukoosin ottoa ja S. mutansin glukaani- ja fruktaanituotantoa «Loimaranta V, Tenovuo J, Virtanen S, Marnila P, Syväoja EL, Tupasela T, Korhonen H. Generation of bovine immune colostrums against Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus and its effect on glu»23. Ihmiskokeessa voitiin osoittaa, että heralla purskutelleilla vasta-aineet estivät S. mutansin kiinnittymisen kokeelliseen pellikkeliin. Tätä auttoi myös ihmisen leukosyyttien kyky koota ja tehdä vieraat aineet vaarattomiksi (fagosytoosi) «Loimaranta V, Carlen A, Olsson J, Tenovuo J, Syvaoja EL, Korhonen H. Concentrated bovine colostral whey proteins from Streptococcus mutans/ Streptococcus sobrinus immunized cows inhibit the adherence »24 (esim. S. mutansin tappaminen) sekä S. mutansin pienempi määrä «Loimaranta V, Nuutila J, Marnila P, Tenovuo J, Korhonen H, Lilius EM. Colostral proteins from cows immunised with Streptococcus mutans/ Streptococcus sobrinus support the phagocytosis and killing of m»25. Hiljattain julkaistussa artikkelissa kerrottiin naudasta peräisin olevista vasta-aineista, jotka kohdistuivat synteettiseen proteiiniin, joka käsitti PAC:in sylkeä sitovan osan (SAI/II) sekä glukaania sitovan (Gtf-I) osan. Tätä immuunituotetta saaneille rotille todettiin muodostuvan vähemmän kariesta «Mitoma M, Oho T, Michibata N, Okano K, Nakano Y, Fukuyama M, et al. Passive immunization with bovine milk containing antibodies to a cell surface protein antigen-glucosyltransferase fusion protein pro»26. Kahden tärkeän virulenssitekijän yhdistäminen on mielenkiintoinen tapa lisätä rokotteen tehoa. Tutkimukset osoittavat, että naudasta peräisin olevia vasta-aineita ja ternimaitotuotteita voidaan käyttää ihmisen passiivisessa immunisaatiossa, koska suurin osa ihmisistä sietää maitoa. Nykyäänkin jo päivittäistavarakaupoissa myydään immunisoimattomien eläinten ternimaitotuotteita, kuten esimerkiksi hammastahnaa. Tuotteiden väitetään suojaavan infektioilta, mutta ne eivät sisällä spesifejä vasta-aineita.

Kananmunasta peräisin olevat vasta-aineet

Immuniteetin siirtyminen kanasta sen jälkeläiseen munassa kuvattiin jo yli sata vuotta sitten «Klemperer F. Ueber natürliche Immunität und Verwerthung für die Immunisierungstherapie. Arch Expl Pathol Pharamakol 1893; 31: 365-382. »27. Passiivisen immuniteetin siirto kanasta kananpoikaan tapahtuu keltuaiskalvon kautta munan kehittyessä «Hatta H, Ozeki M, Kim M, Yamamoto T, Hirasawa M, Otake S, et al. Passive immunization against dental plaque formation in humans: effect of a mouth rinse containing egg yolk antibodies (IgY) specific t»28. Prosessin tarkka kulku on vielä epäselvä. Keltuaiseen siirtyneitä immunoglobuliineja tai vasta-aineita kutsutaan IgY:ksi «Leslie GA, Clem LW. Phylogeny of immunoglobulin structure and function. III. Immunoglobulins of the chicken. J Exp Med 1969; 130: 1337. »29. Lehmillä vasta-ainepitoisuuden kasvu immunisaation jälkeen on melko vähäinen, kun taas kanat saattavat hyperimmunisoitua «Butler JE. Bovine immunoglobulins: an augmented review. Vet Immunol Immunopathol 1983; 4: 43-152. »30. Munankeltuaisen IgY-pitoisuus voi kohota jopa 25 mg:aan/ml. Vuoden aikana yhden kanan IgY-tuotto voi olla 40 grammaa. Luonnollisesti kananmunan vasta-aineiden käyttö passiivisessa immunisaatiossa siis houkuttelee. Kanan tai kananmunan vasta-aineiden on tosin huomattu olevan vähemmän stabiileja ympäristössä, jossa on matala pH (esim. mahalaukku). Ne myös hajoavat herkemmin pepsiinin vaikutuksesta «Hatta H, Ozeki M, Kim M, Yamamoto T, Hirasawa M, Otake S, et al. Passive immunization against dental plaque formation in humans: effect of a mouth rinse containing egg yolk antibodies (IgY) specific t»28.

Kananmunasta peräisin olevia vasta-aineita on käytetty passiivisessa S. mutans- ja kariesimmunisaatiossa. Kariesta muodostui vähemmän rotilla, jotka olivat saaneet kokonaisilla S. mutans -soluilla immunisoitujen kanojen immunoglobuliineja «Otake S, Nishihara Y, Makimura M, Hatta H, Kim M, Yamamoto T, et al. Protection of rats against dental caries by passive immunization with hen-egg-yolk antibody (IgY). J Dent Res 1991; 70: 162-166. »31. Kokeiluja on tehty myös ihmisillä. Vasta-aineilla suutansa huuhdelleilla syljen ja plakin S. mutans -määrä väheni suhteessa streptokokkien kokonaismäärään «Hatta H, Ozeki M, Kim M, Yamamoto T, Hirasawa M, Otake S, et al. Passive immunization against dental plaque formation in humans: effect of a mouth rinse containing egg yolk antibodies (IgY) specific t»28. Kokeita on tehty myös kananpojasta peräisin olevilla solusidonnaista Gtf:ta vastaan suunnatuilla vasta-aineilla. Kun IgY:ta annosteltiin ravinnon mukana, karies väheni «Koga T, Oho T, Shimazaki Y, Nakano Y. Immunization against dental caries. Vaccine 2002; 20: 2027-2044. »1. Kuivasuisilla koe-eläimillä, joille annettiin juomaveden mukana anti-Gtf-vasta-aineita, oli vähemmän kariesta hampaiden sileillä pinnoilla ja fissuuroissa kontrolliryhmään verrattuna «Krüger C, Pearson SK, Kodama Y, Vacca Smith A, Bowen WH, Hammarström L. The effects of egg-derived antibodies to glucosyltransferases on dental caries in rats. Caries Res 2004; 38: 9-14. »32. Tulokset osoittavat, että kananmunasta peräisin olevat vasta-aineet pystyvät toimimaan kuivan suun olosuhteissa ja ovat mahdollinen hoitomuoto kariesaktiivisille potilaille. Vasta-aineita on valmistettu myös yhtä S. mutansin antigeeniä, glukaanisidonnaista proteiinia GBP:ta vastaan. Kun näitä vasta-aineita annettiin ravinnon mukana rotille, havaittiin karieksen vähenemistä poskihampaissa jo lyhyessä ajassa «Smith DJ, Shoushtari B, Heschel RL, King WF, Taubman MA. Immunogenicity and protective immunity induced by synthetic peptides associated with a catalytic subdomain of mutans group streptococcal glucos»33.

Vaikka IgY on vähemmän stabiili kuin ihmisestä tai naudasta peräisin olevat vasta-aineet, se on hyvä ehdokas passiivisessa kariesimmunisaatiossa käytettäväksi saatavuutensa (kananmuna on yleistä ravintoa kaikkialla maailmassa) ja suuren vasta-ainepitoisuutensa ansiosta. Silti passiivinen kariesimmunisaatio kananmunasta peräisin olevilla vasta-aineillakin on nykyään suhteellisen kallista. Jos jokaisen kananmunan "vasta-ainesaalista" voitaisiin lisätä, saattaisi menetelmä olla taloudellisesta näkökulmasta houkuttelevampi.

Monoklonaaliset vasta-aineet

Monoklonaalisia vasta-aineita S. mutansia ja kariesta vastaan on tutkittu laajalti sekä eläimillä että ihmisillä. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat tarttumiskykyisempiä ja spesifimpiä kuin polyklonaaliset vasta-aineet. Niiden valmistus on vaativaa ja kallista ja se tapahtuu soluviljelmissä. Tällaisia vasta-aineita käytetään lähinnä laboratoriokokeissa, joissa niitä tarvitaan hyvin pieniä määriä. Joissakin merkittävissä kariestutkimuksissa monoklonaalisen anti-AgI/II-vasta-aineen annostelu Rhesusapinoiden suuhun on kuitenkin vähentänyt S. mutansin määrää sileillä hammaspinnoilla ja fissuuroissa. Tuloksena kariesta muodostui hitaammin vuoden ajan immunisaation jälkeen «Lehner T, Caldwell J, Smith R. Local passive immunisation by monoclonal antibodies against Streptococcal antigen I/II in the prevention of dental caries. Infect Immun 1985; 50: 796-799. »34. Toiset tutkimukset ovat osoittaneet antigeeni B:hen (SAI/II) kohdistuvien monoklonaalisten vasta-aineiden estävän S. sobrinuksen istuttamisen rotalle «van Raamsdonk M, de Soet JJ, de Graaff J. Effect of monoclonal antibodies on the colonization of rats by Streptococcus sobrinus. Caries Res 1993; 27: 31-37. »35. Ma ym. annostelivat ihmiskokeessa AgI/II:ta vastaan kohdistuvia monoklonaalisia vasta-aineita suoraan hampaille ja onnistuivat estämään S. mutansin kolonisaation «Ma JK, Hunjan M, Smith R, Lehner T. Specificity of monoclonal antibodies in local passive immunization against Streptococcus mutans. Clin Exp Immunol 1989; 77:331-337. »36. Vuonna 1995 onnistuttiin kloonaamaan ja ilmentämään tupakkakasvin (Nicotina tabacum) SAI/II:een kohdistuva hiiren monoklonaalinen vasta-aine «Ma JK, Hiatt A, Hein M, Vine ND, Wang F, Stabila P, et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants. Science 1995; 268: 716-719. »37. Tämä vasta-aine oli ainutlaatuinen, koska se muodostui osittain hiiren vasta-aineesta, mutta sekretorinen osa oli peräisin kanista. Eri osat istutettiin eri tupakkakasveihin, jotka risteytettiin, ja tuloksena oli sekretorinen kasvivasta-aine. Sekretorisen osan ansiosta kasvivasta-aine säilyi kolme päivää, kun esimerkiksi IgG-vasta-aine säilyy vain yhden päivän «Ma JK, Hikmat BY, Wycoff K, Vine ND, Chargelegue D, Yu L, et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans. Nat Med 1998; 4: 601-606.»38. Kasvivasta-aine suojasi koehenkilöitä S. mutans -kolonisaation uusiutumiselta vähintään neljä kuukautta paikallisesta annostelusta «Ma JK, Hikmat BY, Wycoff K, Vine ND, Chargelegue D, Yu L, et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans. Nat Med 1998; 4: 601-606.»38. Tarvitaan kuitenkin paljon tupakkakasveja tuottamaan karieksen passiiviseen immunisaatioon tarvittava määrä vasta-aineita. On silti huimaavaa kuvitella, miten tulevaisuudessa vasta-aineita voitaisiin tuottaa kasveissa.

Laamaeläinten, dromedaarien ja kamelien vasta-ainekoostumus on ainutlaatuinen. Niiden vasta-aineet ovat vastustuskykyisempiä kuumuudelle ja matalalle pH:lle «Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Bajana Songa E, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light-chains. Nature 1993; 363: 446-448. »39. Näiden vasta-aineiden muuttuvaa osaa kutsutaan VHH:ksi ja se on pienin luonnollinen molekyyli, jolla on kyky kiinnittyä antigeeniin «Desmyter, A, Decanniere K, Muyldermans S, Wyns L. Antigen specificity and high affinity binding provided by one single loop of a camel single-domain antibody. J Biol Chem 2001; 276: 26285-26290. »40. VHH-fragmentti on helppo kloonata ja sitä voidaan ilmentää sekä bakteereissa että sienissä «Frenken LGJ, van der Linden HJR, Hermans PWJ, Wil Bos J, Ruuls RC, De Geus B, et al. Isolation of antigen specific Llama VHH antibody fragments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisi»41. VHH-fragmenteille on ominaista sekä suuri spesifisyys että antigeeni-vasta-ainesidoksen voimakkuus (affiniteetti) «van der Linden RH, De Geus B, Frenken GJ, Peters H, Verrips CT. Improved production and function of llama heavy chain antibody fragments by molecular evolution. J Biotechnol 2000; 80: 261-270. »42. Hiljattain tehdyssä tutkimuksessa kehitettiin yhdistetty fuusioproteiini laaman VHH-fragmentista, joka kohdistettiin glukoosioksidaasin (GOx) kanssa yhdistettyyn S. mutansiin. Tämä VHH-GOx-proteiini pystyi tunnistamaan ja sitomaan S. mutansin ja myös pienellä pitoisuudella tekemään bakteerit vaarattomiksi «Szynol A, de Soet JJ, Sieben-van Tuyl E, Bos JW, Frenken LG. Bactericidal effects of a fusion protein of llama heavy-chain antibodies coupled to glucose oxidase on oral bacteria. Antimicrob Agents Che»43. GOx on entsyymi, joka vastaa vetyperoksidin tuotannosta glukoosin ja hapen läheisyydessä. Entsyymillä katsotaan olevan jopa bakteereita tappava vaikutus «Thomas E, Milligan LTW, Joyner RE, Jefferson MM. Antibacterial activity of hydrogen peroxide and the lactoperoxidase-hydrogen peroxide-thiocyanate system against oral streptococci. Infect Immun 1994; »44. Yleisesti ottaen vaaditaan vasta-aineelta bivalenttia rakennetta, jotta se pystyy kasaamaan bakteereita ja jotta sillä on tehoa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, ettei VHH pysty toimimaan yksittäisenä fragmenttina, koska antigeeniin kiinnittyvä muuttuva osa ei yksinään pysty kasaamaan bakteereita yhteen. Tämä tekee VHH-fragmenteista tehottomampia «Ma JK, Lehner T. Prevention of colonization of Streptococcus mutans by topical application of monoclonal antibodies in human subjects. Arch Oral Biol 1990; 35: 115-122. »45. Yllättävää kyllä VHH:n (tai VHH-GOx:n) paikallisen annostelun seurauksena kuivasuisilla rotilla muodostui sileille hammaspinnoille vähemmän kariesta. Emme kuitenkaan pystyneet osoittamaan, että glukoosioksidaasi-entsyymillä olisi ollut lisävaikutusta «Krüger C, Hultberg A, Marcotte H, Frenken LGJ, Hammarström L. Passive immunization against caries using llama derived VHH fragments against Streptococcus mutans. 2005 (Submitted). »46. Laaman vasta-ainefragmenttien etuina on niiden stabiilius ja suuruus. Siksi ne ovat erittäin kiinnostavia tulevaisuuden tutkimusta ja käyttöä ajatellen.

Laktobasillit kariesrokotteen kantajina

Laktobasillit ovat osoittaneet aiemmissa tutkimuksissa vastustuskykyä lisääviä vaikutuksia sekä limakalvon että systeemisessä immuunijärjestelmässä «Isolauri E, Joensuu J, Suomalainen H, Luomala M, Vesikari T. Improved immunogenicity of oral D x RRV reassortant rotavirus vaccine by Lactobacillus casei GG. Vaccine 1995; 13: 310-312. »47. Laktobasilleja on helppo kasvattaa suurinakin pitoisuuksina ja pienillä kustannuksilla. On ollut mahdollista myös geneettisen valinnan kautta ilmentää antigeenin osia laktobasillin pinnalla ja siten aktivoida immuunijärjestelmää «Pouwels PH, Vriesma A, Martinez B, Tielen FJ, Seegers JF, Leer R, et al. Lactobacilli as vehicles for targeting antigens to mucosal tissues by surface exposition of foreign antigens. Methods Enzymol 2»48.

Plasmidi toimii vektorina, joka sisältää geneettistä informaatiota sekä erilaisia signaaleja, jotka vaikuttavat bakteerisoluun niin, että se alkaa lukea, tuottaa tai esimerkiksi kuljettaa tiettyä proteiinia solukalvolle. Plasmidissa on useimmiten jonkinlainen antibioottiresistenssin merkkiaine, jotta pystytään valikoiden kasvattamaan muunnettuja bakteereja. Jos tätä merkkiainetta ei ole, bakteeri hankkiutuu eroon "taakastaan" (lisätystä geneettisestä fragmentista) ja proteiinin tuotanto loppuu. Vasta-aineen ilmentäminen laktobasillin pinnalla ei ole mahdollista vasta-ainemolekyylin suuren koon takia. Yhden vektorin vapaus on erittäin rajattu ja se pystyy ilmentämään vain pieniä proteiineja. Klassisessa vasta-aineessa bivalentti rakenne muodostuu ohuesta, kevyestä ketjusta, jossa on antigeeniin sitoutuva osa, Fab, ja pysyvä Fc-osa, joka toimii signaalina muulle immuunijärjestelmälle. Niin kutsuttu "single chain-fragment" (ScFv) käsittää pelkästään kevyen ja ohuen antigeeniä sitovan ketjun, jota pitää koossa ns. linker. Niitä ei valmistu luonnossa vaan molekyylibiologisin menetelmin. Olemme onnistuneet valmistamaan S. mutansin SAI/II-proteiiniin kohdistuvan single chain -fragmentin geenin ja saaneet sen ilmentymään Lactobasillus paracasein pinnalla. Alkuperäinen vasta-aine on monoklonaalinen hiirivasta-aine, jota on aiemmin testattu sekä eläimillä että ihmisillä «Ma JK, Lehner T. Prevention of colonization of Streptococcus mutans by topical application of monoclonal antibodies in human subjects. Arch Oral Biol 1990; 35: 115-122. »49. Muunnetut laktobasillit, joiden pinnassa oli ScFv:ta, kasaantuivat S. mutansin kanssa «»2. Näiden laktobasillien antaminen juomavedessä sai aikaan vähemmän karieksen muodostumista kuivasuisten rottien sileillä hampaanpinnoilla «Krüger C, Hu Y, Pan Q, Marcotte H, Hultberg A, Delwar D, et al. In situ delivery of passive immunity by lactobacilli producing single-chain antibodies. Nat Biotechnol 2002; 20: 702-706. »6.

Tulokset ovat monella tavalla ainutlaatuisia. Ensimmäistä kertaa oli mahdollista ilmentää vasta-ainefragmentin toimintaa maitohappoa tuottavien laktobasillien pinnalla. Muuntuneet laktobasillit voivat tilapäisesti kolonisoitua suuhun ja suoraan paikan päällä tuottaa S. mutansiin kohdistuvan vasta-ainefragmentin ja siten estää kariesta. Näiden niin sanottujen muuntajien kanssa jatketussa työssä on muun muassa paranneltu vektorien tiettyjä osia ja vaihdettu toisiin. Toisessa vektorisarjassa muunnettiin niin kutsuttu promoottori siten, että se ilmensi pysyvästi ScFv:ta (erona ensimmäisiin vektoreihin, jotka käynnistettiin mannitolilla). Saimme selville, että uudetkin muuntajat voivat ilmentää toiminnallista vasta-ainefragmenttia L. paracasein pinnalla. Karieksen määrä väheni, kun niitä annettiin kuivasuisille rotille. Kariesta kehittyi myös jonkin verran vähemmän kuin laktobasilleilla, joista kerrottiin edellä «Krüger C, Hultberg A, Marcotte H, Ma JK, Hammarström L. Passive immunization by lactobacilli expressing single-chain antibodies against Streptococcus mutans. 2005 (Submitted). »17. On oletettu, että single chain -vasta-aineet tunnistavat uudelleen, kiinnittyvät ja estävät SAI/II:ta ja estävät tällä tavalla S. mutansin kiinnittymisen hampaan pinnalle.

Koetulosten ansiosta avautuu uusia mahdollisuuksia. Laktobasillimme kasaavat hyvin S. mutansia ja pienellä määrällä ScFv:ta solukalvolla ne kenties saavat bivalentteja tai multivalentteja vasta-aineita muistuttavia ominaisuuksia. Vasta-ainefragmentti voisi teoreettisesti toimia myös kohteen etsijänä ja sitoa laktobasilleja S. mutansiin, ja estävien tekijöiden tuotanto tekisi S. mutansista vaarattoman. Tämä on tosin vasta teoreettista ajattelua. Mekanismin kartoittamisessa ja järjestelmän kehittämisessä on vielä paljon työtä.

Nykyään plasmidipohjainen järjestelmä on liian epävarma ja sisältää antibioottiresistenttejä geenejä. Siksi se ei sovellu tutkittavaksi ihmisellä. Uusia menetelmiä on kehitteillä. On täysin mahdollista valita ihmisestä peräisin oleva laktobasillikanta, joka tuottaa vain vähän maitohappoa ja jota voidaan siten käyttää karieksen estämiseen. Tällaisen rokotteen kustannukset tulisi saada pieniksi, jotta toimenpide tavoittaisi potilaat. Tällä hetkellä tosin yleinen suhtautuminen geenimanipuloituihin mikrobeihin ei ole myönteistä.

Yhteenveto ja tulevaisuuden näkymät

Passiivinen immunisaatio on tutkimuksissa osoittautunut menestyksekkääksi karieksen ehkäisymenetelmäksi. Sillä on monia etuja: se on nopeaa, paikallista ja varmaa, eikä sillä ole suuria sivuvaikutusriskejä. Se ei aktivoi immuunijärjestelmää, mikä eliminoi vasta-aineiden ristireagoinnin. Ihmisille on tehty vähän tutkimuksia, ja menetelmän vaikutukset on osoitettu vain bakteeritasolla eikä karieskehityksessä. Toisin sanoen lisätutkimusta tarvitaan.

Karieksen syynä on S. mutans, mutta karies on monitekijäinen sairaus. Karieksen ehkäisy ja hoito tulee suunnata kaikkiin tekijöihin. Passiivinen immunisaatio on yksi mahdollisuus täydentää perinteistä karieshoitoa ja -ehkäisyä. Sitä voidaan pitää kariesta aiheuttavia mutans-streptokokkeja vastaan suunnattuna hoitona. Suun kuivuudesta kärsivien potilaiden mikrofloorassa on enemmän kariekseen liittyviä bakteereja «Almståhl A, Wikström M. Oral microflora in subjects with reduced salivary secretion. J Dent Res 1999; 78: 1410-1416. »50, ja sädehoitoa saaneille potilaille muodostuu nopeasti kariesta «Spak CJ, Johnson G, Ekstrand J. Caries incidence, salivary flow rate and efficacy of fluoride gel treatment in irradiated patients. Caries Res 1994; 28: 388-393. »51. Suunhuuhteluaineessa annettava passiivinen immunisaatio voisi olla hyvä vaihtoehto kuivasuisille potilaille, joiden limakalvot ovat hauraat. Tämänhetkisen tiedon perusteella kariesaktiiviset potilaat tarvitsisivat todennäköisesti useampia hoitojaksoja vuodessa. Potilas voisi kuitenkin tehdä toimenpiteen itse kotona (suuhuuhteluna tai imeskelytabletteina).

Karies ei ole hengenvaarallinen sairaus, ja kariesrokotteen kehittämisen kustannukset tulee suhteuttaa siihen. Vasta-aineella varustettujen, maitohappoa tuottavien laktobasillien tuottaminen voi olla yksi tulevaisuuden mahdollisuus. Vielä on paljon työtä tehtävänä, jotta menetelmä saadaan sovellutettua potilastutkimuksiin. Muunnellut laktobasillit ovat jo kehitteillä. Myös muunnettujen laktobasillien toimintamekanismit täytyy kartoittaa. Optimaalista suun laktobasillikandidaattia etsitään. Passiivista immunisaatiota voidaan käyttää sairauksien ehkäisymenetelmänä myös muita mikrobien aiheuttamia suusairauksia vastaan (esim. Candida albicansin ja Porphyromonas gingivaliksen aiheuttamat infektiot).

Passive immunization against caries

Adherence to mucosal surfaces has been shown to be of great importance in the pathogenesis of various infections in the gastro-intestinal tract. In the oral cavity, adhesion to the tooth surface is important and plays a role in colonization of Streptococcus mutans (S. mutans). The oral pathogen S. mutans colonizes the hard tissue surfaces in the human oral cavity and is considered to be the principal etiologic agent of dental caries. S. mutans possesses a variety of virulence traits that enable it to establish itself in the oral cavity and initiate disease. Although the incidence of caries has been reduced due to prophylactic measures during the past decades, there are groups of patients for whom caries remains a major clinical problem. These include individuals with hyposalivation due to adverse effects of certain pharmaceutical products, systemic diseases such as Sjögren´s syndrome, and head and neck tumor patients receiving heavy local irradiation therapy. The effects of passive immunization against S. mutans, has previously been explored using topical oral administration of antibodies derived from both animals and plants. This includes studies with both monoclonal and polyclonal antibodies directed against either the surface adhesion SAI/II and the glucosyltransferases. Still, passive immunization is expensive and new traits need to be explored in order to find safe and cost efficient therapies for oral diseases. Lactobacilli have previously been used to deliver vaccine components for active immunization in vivo. A novel method has been established whereby single-chain Fv (scFv) are produced in situ for delivery of passive immunity. Oral administration of scFv-expressing bacteria in desalivated rats resulted in less S. mutans bacteria and a lower development of dental caries. Lactobacilli are easily cultured and a high concentration of bacteria is achieved. This could be a future strategy for passive immunization in the oral cavity but today tolerance in the society for GMO (gene modified microorganisms) is low.