MMP-8-spesifisen parodontaalitestin tieteellinen perusta ja kehitystyö
EHL, HLL Päivi Mäntylän kliinisen parodontologian alan väitöskirja "The scientific basis and development of a matrix metalloproteinase (MMP) -8 specific chair-side test for monitoring of periodontal health and disease from gingival crevicular fluid" tarkastettiin Helsingin yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa 7. huhtikuuta 2006. Vastaväittäjänä tilaisuudessa toimi professori Maria E. Ryan Stony Brookin yliopistosta New Yorkin osavaltiosta Yhdysvalloista. Kustoksena toimi työn ohjannut professori, ylihammaslääkäri Timo Sorsa Helsingin yliopistosta ja Helsingin yliopistollisesta keskussairaalasta. Väitöskirjan esitarkastivat professori Anders Gustafsson Karoliinisesta Instituutista Tukholmasta ja professori Veli-Matti Kähäri Turun yliopistosta.
Parodontaalisairaudet ovat mikrobien käynnistämiä, eri tavalla rajoittuvia ja eteneviä tulehdustiloja. Myös gingiviitissä tuhoutuu sidekudoksen kollageenisäikeitä, mutta kudos korjautuu ennalleen, kun aiheuttavat tekijät poistetaan. Pitkäaikainenkaan gingiviitti ei etene kuin osalla ihmisistä hampaan säikeistä kiinnitystä ja hammasta kiinnittävää leukaluuta peruuttamattomasti tuhoavaksi parodontiitiksi. Sairastumisriskin taustalla on altis yksilö, jolla yhdistyvät perinnölliset tekijät, elämäntapatekijät sekä parodontiitin kehittymiselle ominainen mikrobifloora. Huomattava osa parodontiittipotilaista ja huonosti hoitoon vastaavista tapauksista on tupakoitsijoita. Myös diabeteksen tiedetään lisäävän parodontiittiriskiä.
Vasteena mikrobeille isäntäyksilön solut vapauttavat välittäjäaineita, joiden tarkoituksena on rajoittaa mikrobien tunkeutuminen syvemmälle kudoksiin ja eristää tulehdusalue terveestä kudoksesta. Isäntäyksilön omien kudosten monimutkainen vaste, eivät bakteeriperäiset tekijät, aiheuttavat parodontiumin sekä pehmeiden että kovien kudosrakenteiden tuhoutumisen. Parodontiitissa kudostuho on siis seurausta ei-toivotusta, liioitellusta tulehdusvasteesta sille alttiilla henkilöllä.
Hampaiden kiinnityskudostuho jää helposti varhaisvaiheissaan diagnostisoimatta. Parodontiitin eteneminen voi olla aaltoilevaa: aktiivista tulehdusvaihetta saattaa seurata paranemista, jota taas seuraa tulehduksen uusi aktivoituminen ja kudostuhon eteneminen samanaikaisesti koko hampaistossa tai sen joissain osissa. Yleisesti käytössä olevat menetelmät parodontiitin diagnostisoimiseksi perustuvat pääasiassa jo tapahtuneen kiinnityskudostuhon rekisteröimiseen eli määritämme sairauden seurauksia, emme sen aktiviteettia.
Parodontaalisairauden toteaminen ennen merkittävää kudostuhoa, mieluiten jo niiden yksilöiden tunnistaminen, joilla on parodontiittiriski, auttaisi hammaslääkäreitä kohdentamaan hoitotoimensa oikeisiin yksilöihin ja ehkäisemään sairauden kehittyminen. Taas niillä potilailla, joilla parodontiitti on jo tehnyt palautumatonta tuhoa, on hoidettunakin jatkuva sairauden uusiutumisen tai sen etenemisen eli taudin uuden aktivoitumisen riski. Tämän määrittäminen nykyisillä diagnostisilla menetelmillä ei ole ongelmatonta. Myös hammaspuutoksia korvaamaan asetettujen implanttien kiinnitystä uhkaa tulehdusprosessi yhtälailla kuin hampaita.
Parodontaalisairauksien kliiniskemiallisen diagnostiikan mahdollisuudet
Suun biologiset nesteet, sylki ja ientaskuneste, tarjoavat oivallisen mahdollisuuden biokemiallisiin määrityksiin. Näiden nesteiden kerääminen määrityksiin on kajoamatonta ja soveltuu tavanomaisen hammashoitokäynnin yhteyteen. Sylki soveltuu yleiseen suusairauksien diagnostiikkaan ja potilaskohtaisen riskin arviointiin. Ientaskuneste taas heijastelee paikallisesti erinomaisesti läheisen kudoksen terveydentilaa. Erityisesti tulehdustilanteessa ientaskunesteessä on runsaasti kokonaisia soluja sekä entsyymejä ja niiden estäjiä, tulehduksen välittäjäaineita, immuunipuolustuksen tuotteita sekä kudoksen hajoamistuotteita. Tämän seikan innostamana ientaskunesteen koostumusta on tutkittu päämääränä sellaisen kudosperäisen merkkiaineen löytäminen, joka osoittaisi parodontiitin aktiivivaiheen ja mahdollisesti myös ilmaisisi yksilöllisen sairastumisalttiuden tai ennakoisi hoitovastetta.
Matriksin metalloproteaasi (MMP) -entsyymiperheeseen kuuluva kollagenaasi-2 eli MMP-8 on todettu hampaiden kiinnityskudosta palautumattomasti tuhoavassa kroonisessa parodontiitissa keskeiseksi entsyymiksi. Pääosa MMP-8:sta on peräisin neutrofiili-valkosoluista, mutta myös muut tulehdussolut sekä tulehduksen ärsyttämät kudoksen omat solut voivat tuottaa ja vapauttaa MMP-8:aa. MMP-8 vapautuu soluista epäaktiivisena ja aktivoituu tulehduspaikalla. Mitä vaikeampi tulehdus, sitä enemmän entsyymistä on aktiivisessa muodossa. Aktiivinen MMP-8 kykenee hajottamaan lähes kaikkia sidekudoksen soluväliaineen sekä tyvikalvon rakenneosia. Ennen kaikkea se hajottaa tehokkaasti sidekudoksen keskeistä rakennusainetta, tyypin I kollageenia. Kaikkien MMP-entsyymien tavoin MMP-8 osallistuu myös elimistön normaaleihin fysiologisiin toimintoihin, kuten haavan paranemiseen ja lisääntymisen eri vaiheisiin.
Työn tarkoitus ja menetelmät
Väitöskirjatyön tärkein tutkimuskohde oli ientaskunesteen MMP-8-määrityksen diagnostinen arvo parodontaalikudosten terveydentilan seurannassa. Tutkimusta varten kehitettiin immunokromatografiaan perustuva, kahta monoklonaalista vasta-ainetta hyödyntävä ientaskunesteestä tai peri-implanttinesteestä vastaanottotilanteessa tehtävä, tietyn raja-arvon (1000 µg/l) ylittävää MMP-8-pitoisuutta määrittävä tuolinvierus-tikkutesti.
Poikkileikkaustutkimuksessa määritettiin hampaiden kiinnityskudoksilta terveiden henkilöiden sekä hoitamattomien gingiviitti- ja parodontiittipotilaiden valikoitujen hampaistokohtien ientaskunesteen MMP-8-pitoisuutta immunofluorometrisellä menetelmällä ja näytteistä tehtiin vastaanottotilanteessa pikatesti. Parodontiittipotilailta määritys tehtiin ennen hoitoa ja hoidon (eli hammaskiven ja biofilmin poiston ja juuripintojen tasoituksen) jälkeen sen selvittämiseksi, miten hoito vaikuttaa ientaskunesteen MMP-8-pitoisuuksiin sekä MMP-8-tuolinvierus-tikkutestin tuloksiin.
Pitkittäistutkimuksessa seurattiin parodontiittipotilaita hoidon päättymisen jälkeen vuoden ajan kahden kuukauden välein ns. ylläpitovaiheessa. Työn tarkoituksena oli selvittää MMP-8:n testauksen arvo parodontiumin kudostuhon ennustamisessa. Jokaisella käyntikerralla tutkimuspotilailta kerättiin ientaskunestenäytteet samoista hampaiston kohdista ja näytteistä tehtiin pikatesti sekä laboratoriossa immunofluorometrinen pitoisuusmääritys. Näytteenottokohdista tehtiin myös kliiniset mittaukset (määritettiin ientaskun syvyys, kiinnitystaso ja ientaskun verenvuoto). Ylläpitovaiheen tulokset analysoitiin tarkastellen ylläpitovaiheen lopussa kiinnitystä menettäneiden kohtien ja stabiileina säilyneiden kohtien MMP-8-pitoisuuden ja testituloksen muutoksia tutkimuspotilaiden tupakointi huomioiden.
Väitöstyön osana tutkittiin myös parodontiittipotilaiden syvien ientaskujen bakteerinäytteistä merkkejä Chlamydia pneumoniaesta polymeraasiketjureaktio-menetelmällä. C. pneumoniaeta ei voida pitää tyypillisenä parodontiitin aiheuttajabakteerina, mutta sillä saattaa olla merkitystä paikallisen ja yleisen tulehdusvasteen aktivoijana. Syvien ientaskujen bakteeripeitteet ovat myös mahdollinen tartuntareitti ihmisten välisissä kontakteissa.
Tulokset
Verratessamme parodontiittipotilaiden ientaskunestenäytteiden elastaasi- ja MMP-8-pitoisuuksia ilmeni, että elastaasin aktiviteetin perusteella määritetty pitoisuus korreloi huonommin kuin immunologisella menetelmällä määritetty MMP-8-pitoisuus kliinisten muuttujien kanssa.
Parodontiittipotilaiden ientaskunesteen MMP-8-pitoisuus laski hoidon jälkeen edelleen kolmen kuukauden seurannassa. Todennäköisesti tämä ilmentää parodontaalisen haavan paranemiseen kuluvaa aikaa ja myös kuvastaa MMP-8:n normaalifysiologiaan liittyvää suojaavaa toimintaa.
Poikkileikkaustutkimuksessa parodontaalisesti terveillä, gingiviittiyksilöillä ja hoitamattomilla parodontiittipotilailla ientaskunesteen MMP-8-pitoisuudet olivat selkeästi eri tasoilla. Asetetulla pikatestin positiivisuuden raja-arvolla kiinnityskudoksiltaan terveillä ja gingiviittiä potevilla henkilöillä tikkutestin tulos oli harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta negatiivinen ja pitoisuudet pieniä. Parodontiittipotilailla hoitoa edeltävä pitoisuus oli suuri ja testitulos useimmiten positiivinen, sitä voimakkaammin mitä syvempi ientasku oli kyseessä. Testitulos siis korreloi hyvin ennen hoitoa tehdyn pitoisuusmäärityksen ja kiinnityskudosten kliinisen terveydentilan kanssa. Parodontiittipotilailla ientaskunesteen MMP-8-pitoisuudet laskivat hoidon tuloksena, mutta jäivät kuitenkin useimmissa tapauksissa suuremmiksi kuin parodontaalisesti terveillä tai gingiviittiyksilöillä.
Vuoden kestäneen ylläpitovaiheen aikana parodontiittipotilaiden kiinnitystä menettävissä hampaiston kohdissa ientaskunesteen MMP-8-pitoisuus oli toistuvasti kohollaan, kun taas stabiileissa kohdissa pitoisuudet pysyivät pieninä. Tämä oli todettavissa myös testillä. Tupakoivien parodontiittipotilaiden ientaskunesteen MMP-8-pitoisuus oli ennen hoitoa sekä sen jälkeen ja ylläpitovaiheen aikana yleisesti pienempi kuin ei-tupakoivilla «»1, mutta myös tupakoivien potilaiden ylläpitovaiheessa kiinnitystä menettävien kohtien MMP-8-pitoisuus kohosi samalle tasolle kuin ei-tupakoitsijoiden vastaavissa kohdissa. Lisäksi kaikkein korkeimmat ientaskunesteen MMP-8-pitoisuudet löytyivät tiettyjen tupakoitsijoiden näytteistä «»2. Näillä henkilöillä vaste parodontaalihoidolle oli huono määritettynä ientaskujen madaltumisena ja kiinnitystason paranemisena, ja kiinnityskudosten tilanne säilyi epävakaana huolimatta säännöllisestä ylläpitovaiheen seurannasta ja sen aikana tehdyistä toimenpiteistä. Erityisesti nämä yksilöt olivat erotettavissa kehittämällämme tuolinvierus MMP-8-tikkutestillä.
Aineistomme perusteella C. pneumoniae voi löytyä syvän ientaskun bakteeribiofilmistä. Parodontaalihoitoa edeltävä näytetulos oli yhdellä potilaalla positiivinen, ja hoidon jälkeen tulos oli negatiivinen. Kyseinen potilas ei muiden muuttujien osalta poikennut muista tutkimushenkilöistä.
Johtopäätökset
Tulosten perusteella voidaan päätellä, että ientaskunesteen MMP-8-pitoisuuden määrityksellä voidaan erottaa parodontaalisesti terveet, gingiviittiyksilöt ja parodontiittipotilaat toisistaan. Näin ollen kehittämämme testin positiivisuuden raja-arvo on mahdollisesti hyödyllinen pyrittäessä tunnistamaan ne yksilöt, joilla on riski gingiviitin etenemiseen parodontiitiksi. Ylläpitovaiheessa parodontiittipotilaan toistuvasti kohollaan oleva yksittäisen ientaskun MMP-8-pitoisuus, joka on todettavissa kehittämällämme tuolinvierus MMP-8-pikatestillä, todennäköisesti osoittaa kiinnityskudosmenetyksen etenemisen riskiä. Pitoisuusmäärityksellä ja testillä myös löydetään ne yksilöt, joiden vaste hoidolle on huono.
C. pneumoniae -löydöksen merkitys on selvitettävä suuremmalla aineistolla.
Matrix metalloproteinase (MMP)-8 specific chair-side test for monitoring of periodontal health and disease
Matrix metalloproteinase (MMP) -8, collagenase-2, is a key mediator of irreversible tissue destruction in chronic periodontitis and detectable in gingival crevicular fluid (GCF). Thus the expression of MMP-8 in GCF could be valuable in monitoring the activity of periodontitis and possibly offers a diagnostic means to predict progression of periodontitis.
In this study the value of MMP-8 detection from GCF in monitoring of periodontal health and disease was evaluated with special reference to its ability to differentiate periodontal health and different disease states of the periodontium and to recognise the progression of periodontitis, i.e. active sites. For chair-side detection of MMP-8 from the GCF or peri-implant sulcus fluid (PISF) samples, a dip-stick test based on immunochromatography involving two monoclonal antibodies was developed.
It was concluded that MMP-8 concentrations in GCF of sites from periodontally healthy individuals, subjects with gingivitis or with periodontitis are at different levels. The cut-off value of the developed MMP-8 test is at an optimal level to differentiate between these conditions and can possibly be utilised in identification of individuals at the risk of the transition of gingivitis to periodontitis. In periodontitis patients, repeatedly elevated GCF MMP-8 concentrations may indicate sites at risk of progression of periodontitis as well as patients with poor response to conventional periodontal treatment (SRP). This can be monitored by MMP-8 testing. Despite the lower mean GCF MMP-8 concentrations in smokers, a fraction of smokers' sites expressed very high MMP-8 concentrations together with enhanced periodontal activity and could be identified with MMP-8 specific chair-side test.
Osajulkaisut
I Chen HY, Cox SW, Eley BM, Mäntylä P, Rönkä H, Sorsa T. Matrix metalloproteinase-8 levels and elastase activities in gingival crevicular fluid from chronic adult periodontitis patients. J Clin Peridontol 2000; 27: 366-369.
II Sorsa T, Mäntylä P, Rönkä H, Kallio P, Kallis G-B, Lundqvist C, Kinane DF, Salo T, Golub LM, Teronen O, Tikanoja S. Scientific basis of a matrix metalloproteinase-8 specific chair-side test for monitoring periodontal and peri-implant health and disease. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: 130-140.
III Kinane DF, Darby IB, Luoto H, Sorsa T, Tikanoja S, Mäntylä P. Changes in gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase-8 levels during periodontal treatment and maintenance. J Periodontal Res 2003; 38: 400-404.
IV Mäntylä P, Stenman M, Kinane DF, Tikanoja S, Luoto H, Salo T, Sorsa T. Gingival crevicular fluid collagenase-2 (MMP-8) test stick for chair-side monitoring of periodontitis. J Periodontal Res 2003; 38: 436-439.
V Mäntylä P, Stenman M, Kinane D, Salo T, Suomalainen K, Tikanoja S, Sorsa T. Monitoring periodontal disease status in smokers and non-smokers using a gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) specific chair-side test. J Periodontal Res 2006, in press.
VI Mäntylä P, Stenman M, Paldanius M, Saikku P, Sorsa T, Meurman JH. Chlamydia pneumoniae together with collagenase-2 (MMP-8) in periodontal lesions. Oral Dis 2004; 10: 32-35.
Kiitokset työtä apurahoilla tukeneille Suomen Hammaslääkäriseura Apollonialle, Suomen Akatemialle sekä HUS-EVO-rahastolle (TI020Y0002, TYH 5306 and TYH 6104)
paivi.mantyla@helsinki.fi