Dioksiinin kehityksellinen hammas- ja sylkirauhastoksisuus
HLL Anu Kiukkosen lastenhammashoidon ja suupatologian alaan kuuluva väitöskirja "Toxicity of dioxin to developing teeth and salivary glands. An experimental study" tarkastettiin Helsingin yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa 16. kesäkuuta 2006. Vastaväittäjänä tilaisuudessa toimi professori Juha Tuukkanen Oulun yliopistosta ja kustoksena professori Satu Alaluusua. Työn olivat ohjanneet dosentti Pirjo-Liisa Lukinmaa ja professori Satu Alaluusua Helsingin yliopistosta. Väitöskirjan esitarkastivat professori Jorma Toppari Turun yliopistosta ja professori Seppo Vainio Oulun yliopistosta.
Dioksiinit ja niiden kaltaiset aineet ovat kaikkialla esiintyviä ympäristömyrkkyjä, joiden kyky aiheuttaa syöpää ja kehityshäiriöitä eläimissä on lisännyt huolenaihetta niiden vaikutuksista ihmiseen. Dioksiinit ovat rasvaliukoisia ja ne kertyvät ravintoketjuun. Ihmisten tärkein dioksiinilähde onkin ravinto. Dioksiineista myrkyllisin on koko yhdisteryhmän malliyhdisteenä käytetty 2,3,7,8-tetra-klooridibentso-p-dioksiini (TCDD eli dioksiini). Sitä pidetään ihmiselle syöpävaarallisena, mutta sen ainoa kiistaton, voimakkaan altistuksen vaikutus on klooriakne. Laboratorioeläimissä TCDD häiritsee epiteelin ja mesenkyymin välisten vuorovaikutusten tuloksena muodostuvien elinten kehitystä ja aiheuttaa esimerkiksi kitalakihalkioita ja munuaisten, rintarauhasten ja prostatan kehityshäiriöitä.
Valtaosa dioksiinien vaikutuksista välittynee spesifin Ah (aryl hydrocarbon) -reseptorin kautta. Ah-reseptori on solunsisäinen transkriptiotekijä, joka ligandin aktivoimana liittyy ARNT (aryl hydrocarbon nuclear translocator) -proteiiniin. Kompleksi siirtyy tumaan, jossa sen käynnistämä ketjureaktio johtaa vierasaineita poistavien entsyymien transkriptioon maksassa. Ah-reseptorin fysiologista ligandia ei tunneta, mutta reseptori vaikuttaa ulkoisesta ligandista riippumatta solun erilaisiin signalointikaskadeihin ja osallistuu mm. solusyklin ja ohjelmoituneen solukuoleman (apoptoosin) säätelyyn.
Altistumisen voimakkuudesta riippuen ihmisen kehittyvät hampaat voivat olla herkkiä dioksiineille. TCDD on toksinen myös jyrsijöiden kehittyville hampaille ja alhaisimmat dioksiiniannokset, jotka estävät rotan hampaan kehittymisen in vivo ovat samaa suuruusluokkaa kuin ne, jotka on yhdistetty lasten hampaiden kiillevaurioihin. Ah-reseptorin ajatellaan toimivan samalla tavalla eri lajeilla. Ottaen huomioon lajien väliset herkkyyserot ja elinviljelyn rajoitukset, kokeellisia tuloksia TCDD:n vaikutuksista hampaankehitykseen voidaankin kriittisesti soveltaa ihmiseen, jolla nähdään vain häiriintyneen kehityksen morfologiset seuraamukset.
Sekä hammas että sylkirauhanen kehittyvät epiteelin ja mesenkyymin välisten induktiivisten vuorovaikutusten tuloksena ja niiden varhaiskehitys muistuttaa merkittävästi toisiaan. Hampaan kehitys jaetaan initiaatioon, morfogeneesiin, hammassolujen erilaistumiseen ja kovakudosten muodostumiseen ja niiden mineralisaatioon, joiden aikataulu tunnetaan tarkoin. Sylkirauhasen kehitysvaiheet ovat jossain määrin epämääräisempiä. Toisin kuin luukudos, kiille ja dentiini eivät muodostuttuaan korvaudu ja kehityksen aikainen hammassolujen vakava vaurioituminen jättää niihin pysyvän jäljen.
Tavoite
Väitöskirjatyön tavoiteena oli kuvata TCDD:n toksisia vaikutuksia rotan ja hiiren kehittyviin hampaisiin ja sylkirauhasiin in vivo ja elinviljelmässä sekä selvittää vaikutusten solu- ja molekyylitason mekanismeja.
Työn menetelmät
Hiiren sikiön hampaita ja leuanalussylkirauhasia kasvatettiin elinviljelmässä, johon oli lisätty TCDD:a eri pitoisuuksina. Niitä tarkasteltiin stereomikroskooppisesti ja niistä valmistettiin kudosleikkeitä. TCDD:n vaikutusta elinten kehitystä oleellisesti sääteleviin tekijöihin, solujen lisääntymiseen ja apoptoosiin, sekä sellaisten geenien lähetti-RNA- ja proteiinitason ilmentymiseen, jotka liittyvät vasteeseen TCDD-altistukselle tai joilla on oleellinen tehtävä hampaan ja sylkirauhasen kehityksen säätelyssä, tutkittiin in situ hybridisaatio -menetelmällä ja immunohistokemiallisesti. Rottakantojen herkkyyttä TCDD:n toksisille hammasvaikutuksille verrattiin niiden herkkyyteen TCDD:n akuutille letaalisuudelle emon maidon välityksellä altistetuissa, TCDD:lle vastustuskykyisissä ja herkissä rotissa. Edelleen tutkittiin TCDD:n vaikutusta rotan hammaskudosten mineralisaatioon.
Tulokset
TCDD:n vaikutus hampaisiin oli annosvasteinen ja se liittyi hampaiden tyyppiin ja kehitysvaiheeseen. Hiiren sikiön viljeltyjen molaarien kehitys pysähtyi TCDD:n vaikutuksesta morfogeneesin varhaisimpiin vaiheisiin asti ja myöhemmin altistettujen hampaiden kuspit jäivät mataliksi ennenaikaisen ja lisääntyneen apoptoosin seurauksena apoptoottisesti kuolemaan ohjelmoituneissa kiille-elimen soluissa. Suoranaista vaikutusta solujen lisääntymiseen ei todettu. TCDD huononsi rotan molaarin kiilteen ja dentiinin mineralisaatiota. Tähän liittyi AhR:n ja TCDD:n vaikutuksesta indusoituvan, vierasaineita metaboloivan P4501 A1 -sytokromientsyymin (CYP1A1) ilmentymisen väheneminen, mikä viittaa TCDD:n vaikutuksen kehittyvään hampaaseen välittyvän AhR-teitse. Mineralisaatiota edistävän dentiinin sialofosfoproteiinigeenin ilmentyminen väheni hiiren viljellyissä hampaissa. Rotan jatkuvasti puhkeavan inkisiivin vakava muodostumishäiriö TCDD-altistuksen seurauksena ei liittynyt siihen AhR:n genotyypin muunteluun, jonka vaikutuksesta eri rottakantojen vastustuskyky mm. TCDD:n akuutille letaalisuudelle vaihtelee oleellisesti. Hiiren viljellyn leuanalussylkirauhasen haarautumisen häiriintymiseen TCDD:n vaikutuksesta liittyi CYP1A1:n ilmentymisen lisääntyminen ja toisaalta epidermaalisen kasvutekijän (EGF) reseptorin välityksellä tapahtuvan signaalinkulun estyminen.
Johtopäätökset
Tulokset viittaavat siihen, että AhR:n aktivoituminen kehittyvissä hampaissa ja sylkirauhasissa TCDD:n vaikutuksesta aktivoi solujen muita signalointireittejä ja kehityksellisesti säädeltyjä geenejä. Muutokset ovat kullekin elimelle ominaisia ja niihin vaikuttavat TCDD-annos, epiteelin ja mesenkyymin väliset vuorovaikutukset sekä elimen kehitysvaihe altistuksen ajankohtana. Hampaat ovat alttiita TCDD:n vaikutuksille koko kehityksensä ajan.
Toxicity of dioxin to developing teeth and salivary glands. An experimental study
Dioxins are ubiquitous environmental poisons that have adverse health effects on different species. The majority of their effects are thought to be mediated by the aryl hydrocarbon receptor (AhR). The most toxic dioxin congener, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), is developmentally toxic to rodent teeth.
The aim of this thesis was to delineate the morphological end points of developmental toxicity of TCDD in rat and mouse teeth and salivary glands in vivo and in organ culture as well as to characterize their cellular and molecular background. As shown by stereomicroscopy, histological and immunohistochemical stainings of tissue sections, and in situ hybridization, TCDD interfered with tooth formation; this was dependent on both dose and on developmental stage of the teeth. It prevented early molar morphogenesis in mice and altered cusp shape by selectively enhancing apoptosis in dental epithelial cells. Cell proliferation was not affected. The impaired mineralization of molar enamel and dentin in rats was accompanied by altered expression of AhR and the TCDD-inducible xenobiotic-metabolizing enzyme P4501 A1. TCDD specifically reduced mRNA for the mineralization-related dentin sialophosphoprotein in cultured embryonic teeth of mice. The interference of TCDD with incisor formation in rats was independent of genotypic variation in AhR, which determines the resistance of a rat strain to TCDD acute lethality. The impairment by TCDD of submandibular gland branching morphogenesis in mice was associated with P4501 A1 induction and involved blockage of EGF receptor signalling. In all likelihood, TCDD activated AhR, with consequent activation of other signalling pathways involving developmentally regulated genes. The resultant phenotype was organ specific and was dependent on dose and stage of organogenesis at the time of exposure; it was also modified by epithelial-mesenchymal interactions. Teeth were responsive to TCDD throughout their development.
Osajulkaisut
I Partanen A-M, Kiukkonen A, Sahlberg C, Alaluusua S, Thesleff I, Pohjanvirta R, Lukinmaa P-L. Developmental toxicity of dioxin to mouse embryonic teeth in vitro: arrest of tooth morphogenesis involves stimulation of apoptotic program in the dental epithelium. Toxicol Appl Pharmacol 2004; 194: 24-33. Erratum in: Toxicol Appl Pharmacol 2005; 202: 212-4.
II Gao Y, Sahlberg C, Kiukkonen A, Alaluusua S, Pohjanvirta R, Tuomisto J, Lukinmaa P-L. Lactational exposure of Han/Wistar rats to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin interferes with enamel maturation and retards dentin mineralization. J Dent Res 2004; 83: 139-44.
III Kiukkonen A, Sahlberg C, Lukinmaa P-L, Alaluusua S, Peltonen E, Partanen A-M. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin specifically reduces mRNA for the mineralization-related dentin sialophosphoprotein in cultured mouse embryonic molar teth. Toxicol Appl Pharmacol 2006 (painossa).
IV Kiukkonen A, Viluksela M, Sahlberg C, Alaluusua S, Tuomisto JT, Tuomisto J, Lukinmaa P-L. Response of the incisor tooth to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in a dioxin-resistant and a dioxin-sensitive rat strain. Toxicol Sci 2002; 69: 482-9.
V Kiukkonen A, Sahlberg C, Partanen A-M, Alaluusua S, Pohjanvirta R, Tuomisto J, Lukinmaa P-L. Interference by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin with cultured mouse submandibular gland branching morphogenesis involves reduced epidermal growth factor receptor signaling. Toxicol Appl Pharmacol 2006; 212: 200-11.
Työ on tehty Suomen hammaslääkäriseura Apollonian, Suomen kulttuurirahaston, August ja Lydia Heinon stipendirahaston, Suomen Akatemian (sopimukset 42551, 43353, 206689), EU:n (projekti QLK4-CT-1999-01446) ja HUS-EVO-rahoituksen turvin. Kiitän saamastani tuesta.
HLL (väit.)
anu.kiukkonen@helsinki.fi