Bmp:t ja Runx2 hampaan kehityksessä ja merkitys kleidokraniaalisen dysplasian molekylaarisessa etiologiassa

Tutkimuksen tausta

Sikiön ulkopintaa verhoavasta ektodermistä ja sen alaisesta mesenkyymistä kehittyy useita elimiä, joiden kehityksellä on paljon yhteisiä piirteitä. Samantyyppisten ektodermaalisten elinten, kuten hampaiden ja rauhasten, solutyypit ja kehityksen anatomia on varsin samankaltaista kaikilla nisäkkäillä. Ektodermaalisten elinten kehitystä säätelevät epiteelin ja mesenkyymin vuorovaikutukset, joihin osallistuvat yleisten viestiperheiden molekyylit. Pään ja kasvojen luut muodostuvat hermostopienasta peräisin olevasta ektomesenkyymistä. Luuta muodostuu kahdella mekanismilla, joko välittömästi eli intramembranoottisesti (pää ja kasvot) tai rustoisen välivaiheen kautta eli endokondraalisesti (muut luut). Hampaille ja luille on yhteistä mineralisoituneen kovakudoksen muodostus.

Solujen väliseen viestintään osallistuvien geenien mutaatiot aiheuttavat lukuisia kehityshäiriöitä hampaissa ja pään alueen luissa. On löydetty useita geenimutaatioita, jotka aiheuttavat hampaiden kehityshäiriöitä kuten puuttuvia tai ylilukuisia hampaita tai kiilteen ja dentiinin muodostuksen häiriöitä. Kehityshäiriöitä tai epämuodostumia, jolla on yhteinen kehitysmekanismi tai alkuperä, kutsutaan oireyhtymiksi. Viime vuosina on pystytty selvittämään usean pään ja kasvojen alueen oireyhtymän, kuten kleidokraniaalisen dysplasian, hemifakiaalisen microsomian sekä Treacher Collins -oirehtymän, molekylaarinen etiologia. Kleidokraniaalinen dysplasia on oireyhtymä, jossa esiintyy muutoksia sekä luissa että hampaissa. Oireyhtymään liittyy häiriintynyt pituuskasvu, yleinen luiden poikkeavuus, solisluiden epämuodostumat ja ylilukuiset hampaat. Kleidokraniaalisen dysplasian aiheuttaa mutaatio Runx2-geenissä, joka on välttämätön luusolujen erilaistumiselle.

Tutkimuksen tavoite

Tavoitteena oli tutkia kleidokraniaalisen dysplasian patogeneesia ja sen molekylaarista taustaa, erityisesti Bmp- ja Runx2-geenien merkitystä hampaan kehityksessä. Ensimmäiseksi selvitettiin Bmp2-7-geenien ilmentyminen hampaan kehityksen aikana. Toinen tavoite oli tutkia Runx2-poistogeenisten hiirten hampaan kehityksen fenotyyppi sekä Runx2-geenin ilmentyminen hampaan kehityksen aikana. Lisäksi tutkittiin Runx2-geenin säätelyä ja etsittiin geenejä, joita Runx2 säätelee hampaan kehityksen aikana.

Menetelmät

Geenien ilmentymisen paikan ja ajan perusteella voidaan selvittää geenituotteen mahdollinen toiminta. Geenien ilmentymisen tutkimusmenetelmänä käytettiin RNA in situ hybridisaatiota radioaktiivisella rikillä leimatuilla koettimilla. Bmp2-7- ja Runx2-geenien normaali ilmentyminen tutkittiin kudosleikkeistä hiiren hampaan kehityksen alkuvaiheista kovakudoksen muodostumiseen asti. Runx2-poistogeenisen (-/-) hiiren alkion hampaita tutkittiin ensin histologisesti selvittääkseen milloin ja miten hampaan kehitys on muuttunut. Tutkittiin myös Runx2-geenin ilmentymistä useissa poistogeenisissä hiirissä selvittääkseen sääteleekö kyseinen muunnettu geeni Runx2-geeniä. Lisäksi tutkittiin lukuisten geenien ilmentymistä Runx2-poistogeenisessä hiiressä löytääkseen Runx2:n säätelemiä geenejä. Ei-radioaktiivisia koettimia käytettiin ns. whole mount in situ hybridisaatiossa, jolla tutkitaan kokonaisia kudoksia eikä kudoksista tehtyjä leikkeitä. Menetelmää käytettiin tutkittaessa geenien ilmentymistä kudosviljelyssä tehtyjen kasvatusten ja kokeiden jälkeen. Kudosviljelyssä lisättiin hampaan mesenkyymiin viestimolekyylejä tutkiakseen Runx2-geenin säätelyä ja mahdollisia muutoksia säätelyssä normaalin ja Runx2-poistogeenisen hiiren välillä. Tehtiin myös epiteeli-mesen-kyymi-rekomibinaatioita nähdäkseen onko Runx2-mesenkymaalisen ilmentymisen säätely riippuvainen epiteelistä. Lisäksi Runx2 -/- hiiren hampaita kasvatettiin kudos- ja elinviljelyillä lisäämällä eri kasvutekijöiden proteiinia. Hampaat analysoitiin tämän jälkeen histologisesti todetakseen onko hampaan kehitys normalisoitunut.

Tulokset

Ensimmäiseksi Bmp-geeenien kohdalla huomattiin, että ne pystyvät indusoimaan luun muodostumista. Niillä on lisäksi lukuisia toimintoja eri elinten kehityksessä. Bmp2-7-geenien ilmenemistä tutkittiin varhaisesta hiiren hampaan kehityksestä hampaan kovakudosmuodostukseen asti. Bmp2-, -4 ja -7 erottuivat muista tutkituista Bmp-geeneistä esiintymällä dynaamisesti hampaan kehityksen eri vaiheissa sekä epiteelissä että mesenkyymissä. Tulokset viittaavat siihen, että Bmp:t signaloivat epiteelin ja mesenkyymin välillä sekä hampaan kehityksen alkuvaiheissa että hampaan kovakudoksia muodostavien solujen erilaistumisen aikana. Lisäksi Bmp:t ovat osana hampaan signaalikeskuksen, kiillekyhmyn, signaaliverkostossa, joka säätelee hampaan kaavoittumisen.

Runx2-geenin ilmeneminen hampaan kehityksen aikana rajoittui hampaan mesenkyymiin silmuvaiheesta varhaiseen kellovaiheeseen. Epiteeli-mesenkyymi-rekomibinaatioilla osoitettiin että hampaan epiteeli säätelee Runx2 mesenkymaalista ilmenemistä. In vitro -kokeilla osoitettiin, että epiteelissä ilmenevä fibroblastikasvutekijäperheeseen kuuluva FGF4 säätelee Runx2 ilmenemistä mutta Bmp:t puolestaan eivät. Runx2-poistogeenisten hiirten hampaiden kehitys pysähtyi silmuvaiheeseen. Lisäksi havaitsimme ylimääräisiä silmuja Runx2-poistogeenisen hiiren ylämolaareissa, mikä viittaa siihen, että Runx2 estää ylilukuisten hampaiden muodostumista.

Runx2:n säätelemiä geenejä etsittiin tutkimalla tunnettujen hampaiden kehitystä ohjaavien geenien ilmenemistä Runx2-poistogeenisen hiiren silmuvaiheeseen pysähtyneissä hampaissa ja vertaamalla ilmenemistä normaaliin hiiren hampaaseen. Runx2-poistogeenisen hiiren hampaissa todettiin fibroblastikasvutekijäperheeseen kuuluvan Fgf3:n ilmenemisen olevan hyvin alhainen ja lisäksi Shh-geenin ilmenemisen puuttuvan alamolaareissa ja vähentyneen ylämolaareista.

Johtopäätökset

Tulokset osoittivat, että Bmp:t ja Runx2 säätelevät epiteeli-mesenkyymi-vuorovaikutuksia, jotka ohjaavat hampaan varhaista kehitystä. Runx2 tarvitaan lakkivaiheen kehittymiseen silmuvaiheesta ja se välittää epiteliaalisten FGF-signaalimolekyyien vaikutuksia ja erityisesti mesenkymaalisen Fgf3-geenin ilmenemistä, joka saattaa olla Runx2:n suora kohdegeeni. Tulokset lisäävät kleidokraniaalisen dysplasian patogeneesin ymmärtämistä.

The function of Bmps and Runx2 in normal tooth development and in the pathogenesis of cleidocranial dysplasia

Cleidocranial dysplasia (CCD) is a congenital syndrome where development of both bone and teeth is affected. The syndrome is characterized by short stature, abnormal clavicles, general bone dysplasia and supernumerary teeth. CCD is caused by mutations in Runx2, a transcription factor that is a key regulator of osteoblast differentiation and bone formation.

The first part of this study included extensive analysis of the expression of a family of key signal molecules, the bone morphogenetic proteins (Bmp), during tooth development. Of the seven Bmps analysed, Bmp2, -4, and -7 showed dynamic expression during key stages of morphogenesis This suggests that they transmit a signal between the epithelial and mesenchymal tissues during tooth development and are also part of the signalling networks whereby the enamel knot regulates the patterning of tooth cusps.

In the second part of the study, the role of Runx2 was investigated during tooth development. Analysis of in situ hybridisation showed that expression of Runx2 is restricted to the dental mesenchyme between the bud- and early bell stages of tooth development. Phenotypic analysis of Runx2 -/- mutant tooth development showed that teeth failed to advance beyond the bud stage and that mandibular molars were more severely affected than maxillary molars. In the mesenchyme of Runx2 -/- teeth the expression of Fgf3 was downregulated, and functional analysis indicated that Fgf3 may be a target of Runx2. In the upper molars of Runx2 mutants, extra buddings at the palatal side of the tooth bud occurred, suggesting that Runx2 acts as an inhibitor of successional tooth formation.

In conclusion, these studies showed that BMPs and Runx2 regulate key epithelial-mesenchymal interactions that control advancing morphogenesis of teeth.

Osajulkaisut:

I Åberg, T, Wozney, J, Thesleff I. Expression patterns of bone morphogenetic proteins (Bmps) in the developing mouse tooth suggest roles in morphogenesis and cell differentiation. Dev Dyn 1997; 210: 383-96.

II D'Souza RN, Åberg T, Gaikwad J, Cavender A, Owen M, Karsenty G, Thesleff I. Cbfa1 is required for epithelial-mesenchymal interactions regulating tooth development in mice. Development 1999; 126: 2911-20.

III Åberg T, Cavender A, Gaikwad JS, Bronckers AL, Wang X, Waltimo-Siren J, Thesleff I, D'Souza RN. Phenotypic changes in dentition of Runx2 homozygote-null mutant mice. J Histochem Cytochem 2004; 52: 131-9.

IV Åberg T, Wang X, Kim J-H, Yamashiro T, Bei M, Rice R, Ryoo H-M, Thesleff I. Runx2 mediates FGF signalling from epithelium to mesenchyme during tooth morphogenesis. Dev Biol 2004; 270: 76-93.

Väitöskirjatyötä ovat taloudellisesti tukeneet Suomen Akatemia, Sigrid Juseliuksen säätiö, Suomen Hammaslääkäriseura Apollonia ja National Institute of Health DE 013368.