Oraalisten Actinomyces-lajien tunnistus, esiintyminen ja varhaiskolonisaation merkitys

Tutkimuksen taustaa

Gram-positiiviset Actinomyces-bakteerit toimivat streptokokkien ohella primaarivaiheen kolonisoitujina suun eri pehmyt- ja kovakudospinnoille muodostuvissa biofilmeissä. Niiden merkitys kehittyvän biofilmin tärkeänä rakenneosana perustuu ko-aggregaatiokykyyn (yhdistymiskykyyn) eri bakteerilajien välillä sekä erityisiin adhesiineihin, joiden avulla ne pystyvät vaikuttamaan tarttumiseen. Kiinnostus Actinomyces-lajeja kohtaan on lisääntynyt viime aikoina huomattavasti, koska niitä on esiintynyt kliinisissä näytteissä yhä enenevissä määrin ja aiemmasta kirjallisuudesta poiketen, niiden on havaittu myös olevan osallisena sekä paikallisissa että systeemisissä infektioissa. Lajien luotettava tunnistaminen on kuitenkin ollut ongelmallista. Viimeaikaiset taksonomiset muutokset ja uusien lajien löytyminen ovat entisestään vaikeuttaneet Actinomyces-lajien laboratoriodiagnostiikkaa.

Tutkimuksen tavoitteet ja tärkeimmät tutkimusmenetelmät

Väitöstutkimuksen alkuvaiheessa (osatyöt I-II) tavoitteena oli kehittää kattava fenotyyppisiin testimenetelmiin pohjautuva Actinomyces-lajien identifiointi-ohjeisto ja näitä menetelmiä hyväksikäyttäen arvioida kliinisissä laboratorioissa yleisesti käytettävien kaupallisten testimenetelmien tehokkuutta, kattavuutta ja kehittämistarpeita. Biokemialliseen testaukseen kuuluivat mm. pesäkemorfologian ja erityisesti pigmentaation tunnistus, entsymaattiset testit ja erilaisten entsymaattisten testimenetelmien vertailu sekä sokerifermentaatiosarja. Tunnistukseen kuului myös olennaisena osana Actinomyces-suvulle ominaisen metabolisen lopputuotteen, sukkinaatin mittaaminen kaasukromatografialla. Kaikkia fenotyyppisiä identifiointimenetelmiä verrattiin 16S rRNA-geenin sekvenointiin perustuvaan tunnistukseen. Tämä väitöskirjatyön ensivaiheessa kehitetty luotettava laji-tason identifiointi loi edelleen perustan tutkimukselle, jossa selvitettiin eri Actinomyces-lajien osallisuutta ja merkitystä suun eri pinnoille muodostuvissa biofilmeissä.

Osatyön III tavoitteena oli selvittää eri Actinomyces-lajien ilmaantumista ja kolonisaation pysyvyyttä vastasyntyneen lapsen suun kehittyvässä bakteeristossa kehittämiemme tunnistusmenetelmien avulla. Yhteensä 39 lapsen (2, 6, 12, 18, 24 kk) sylkinäytteiden 428 isolaattia tunnistettiin lajitasolle.

Osatyössä IV selvitimme aktino-mykesten merkitystä epäonnistuneiden hammasimplanttien pinnan kolonisoitujina ja eri lajien osuutta implantin menetykseen johtavassa tulehduksessa. Tutkimusmateriaali koostui 33 menetetystä implanttinäytteestä, joista Actinomyces-sukuun kuuluvat eristykset (115 isolaattia) identifioitiin lajitasolle.

Osatyössä V tavoitteena oli tutkia elektronimikroskopiaa apuna käyttäen, tarttuvatko Actinomyces-lajit implanttimateriaalina käytetyn titaanin pintaan in vitro ja voiko tähän tarttuvuuteen vaikuttaa biomateriaalien pinta-ominaisuuksia muuttamalla. Peri-implantiittityöstä (osatyö IV) saatujen tulosten perusteella valitsimme sopivat Actinomyces-lajit tähän kokeelliseen adheesiotutkimukseen.

Tutkimustulokset ja tutkimuksen merkitys

Tämän väitöskirja-tutkimuksen myötä kehitetyt fenotyyppiset identifiointi-ohjeistot mahdollistavat eri Actinomyces-lajien tunnistamisen kliinisistä näytteistä yhä luotettavammin. Luotettava laji-tason identifiointi loi edelleen perustan tutkimukselle, jossa selvitettiin eri Actinomyces-lajien osuutta ja merkitystä suun pinnoille muodostuvissa biofilmeissä. Tutkimustulokset osoittivat aktinomykesten esiintyvyyden lapsilla nousevan kolmasosasta jopa 97 %:iin kahden ensimmäisen elinvuoden aikana. Actinomyces-lajit siis ilmestyvät aiemmasta tiedosta poiketen suun normaalimikrobistoon hyvin varhaisessa vaiheessa A. odontolyticuksen esiintyessä selkeästi yleisimpänä löydöksenä koko seurantajakson ajan. Muut lajit osoittautuivat riippuvaisiksi hampaiden puhkeamisen myötä tarjoutuvasta uudesta kolonisoitumispinnasta. Tieto eri Actinomyces-lajien ajallisesta kolonisoitumisesta lapsen suun kehittyvään normaalimikrobistoon oli merkittävä tutkittaessa myös niiden osuutta suun infektioissa. Actinomyces-lajit muodostivatkin yleisimmän bakteeriryhmän (94 %) epäonnistuneiden implanttien kolonisoitujina. Myös näissä näytteissä A. odontolyticus osoittautui yleisimmäksi Actinomyces-lajiksi. Lisäksi A. naeslundii, A. viscosus ja A. israelii tunnistettiin yllättävän useista implanttinäytteistä. Tutkimustulokset eri lajien osuudesta biomateriaalien pinnalle kehittyvän bakteeri-biofilmin koostumukseen tuovat uutta tietoa implanttitulehdusten vielä heikosti tunnetusta mikrobiologiasta. In vitro -tutkimus titaanin pintaominaisuuksien vaikutuksesta eri Actinomyces-lajien tarttumiseen osoitti, että elektronimikroskoopissa tarkasteltuna lajeilla on erilainen affiniteetti titaanin pintaan sekä proteiinipinnoitteen että pinnan karheusasteen vaikuttaessa solumääriin. Tutkimustuloksia lajien tarttuvuudesta eri tavoin käsitellyille titaanipinnoille voidaan hyödyntää implantologiassa käytettävien biomateriaalien kehittämisessä bakteerikasvua suosimattomaksi kolonisaation alkuvaiheessa.

Oral Actinomyces species in health and disease: Identification, occurrence and importance of early colonization

In recent years, Actinomyces and related organisms have attracted the attention of clinical microbiologists because of a growing awareness of their presence in clinical specimens and their association with disease. This series of studies aimed to amplify the identification methods for Actinomyces species. With the newly developed identification scheme, the age-related occurrence of Actinomyces in healthy mouths of infants and their distribution in failed dental implants was investigated. Adhesion of Actinomyces species to titanium surfaces processed in various ways was studied in vitro.

The results of phenotypic identification methods indicated a relatively low applicability of commercially available test kits for reliable identification within the genus Actinomyces. However, in the study of conventional phenotypic methods, it was possible to develop an identification scheme that resulted in accurate differentiation of Actinomyces and closely related species, using various different test methods. Genotypic methods based on 16S rRNA sequence analysis of Actinomyces proved to be a useful method for genus level identification and further clarified the species level identification with phenotypic methods. The results of the study of infants showed that the isolation frequency of salivary Actinomyces species increased according to age: thirty-one percent of the infants at 2 months but 97 % at 2 years of age were positive for Actinomyces. A. odontolyticus was the most prominent Actinomyces colonizer during the study period followed in frequency by A. naeslundii and A. viscosus. In the study of explanted dental implants, Actinomyces was the most prevalent bacterial genus, colonizing 94 % of the fixtures. Also in the implants A. odontolyticus was revealed as the most common Actinomyces species. It was present in 84 % of Actinomyces -positive fixtures followed in frequency by A. naeslundii, A. viscosus and A. israelii. In an in vitro study of titanium surfaces, different Actinomyces species showed variation regarding their adhesion to titanium. Surface roughness as well as albumin coating of titanium had significant effects on adhesion.

The use of improved phenotypic and molecular diagnostic methods increased the accuracy of the identification of the Actinomyces to species level. This facilitated an investigation of their occurrence and distribution in oral specimens in both health and disease.

Osajulkaisut

I Sarkonen N, Könönen E, Summanen P, Könönen M, Jousimies-Somer H. Phenotypic Identification of Actinomyces and Closely Related Species Isolated from Human Sources. J Clin Microbiol 2001; 39: 3955-61.

II Santala A-M, Sarkonen N, Hall V, Carlson P, Jousimies-Somer H, Könönen E. Evaluation of Four Commercial Test Systems for Identification of Actinomyces and Some Closely Related Species. J Clin Microbiol 2004; 42: 418-20.

III Sarkonen N, Könönen E, Summanen P, Kanervo A, Takala A, Jousimies-Somer H. Oral Colonization with Actinomyces Species in Infants by Two Years of Age. J Dent Res 2000; 79: 864-7.

IV Sarkonen N, Könönen E, Eerola E, Könönen M, Jousimies-Somer H, Laine P. Characterization of Actinomyces Species Isolated from Failed Dental Implant Fixtures. Anaerobe 2005; 11: 231-7.

V Sarkonen N, Könönen E, Lounatmaa K, Könönen M. Adhesion of Actinomyces Species on Titanium Surface: In Vitro Electron Microscopy Study. Submitted.