Matriksin metalloproteinaasien inhibiittorit ja uusi immunomodulaattori kykenevät estämään kielisyövän kasvua

Tutkimuksen taustaa

Matriksin metalloproteinaasit (MMP:t) on paljon syöpätutkimuksen kohteena ollut entsyymiryhmä, koska niillä on kyky hajottaa suurinta osaa solunulkoisen matriksin ja tyvikalvon rakenneosasista sekä kyky aktivoida useita kasvutekijöitä. Laaja MMP:n esto on osoittautunut kliinisissä kokeissa ongelmalliseksi, sillä ne ovat mukana useissa fysiologisissa tapahtumissa. MMP:ita, etenkin gelatinaaseja MMP-2 ja MMP-9, on pidetty syövän etenemisen kannalta merkittävänä ja proteolyyttisten funktioiden ohella ne osallistuvat myös syöpäkasvaimen verisuonten uudismuodostukseen. Myös solukalvosidonnaisella MT-1-MMP:lla (MMP-14) on osoitettu olevan vaikutusta syöpäsolujen käyttäytymiseen ja sitä kautta ehkä myös taudin ennusteeseen.

Solujen liikkumisessa eräät tärkeimmistä ankkuriproteiineista ovat erilaiset integriinit. Valkosolulinjaan kuuluvissa soluissa proMMP-9 ja ?₂-integriini paikantuvat niiden liikkuessa samalle alueelle, mikä tarjoaa mielenkiintoisen kohteen sekä syövän että tulehdusreaktion kokeelliseen estoon. Tulehduksen onkin vahvasti osoitettu liittyvän syövän etenemiseen, ja ison osan tuumorin entsyymeistä syntyvän siihen hakeutuneissa leukosyyteissä.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, voidaanko kielisyövän kasvua, verisuonimuodostusta, sekä MMP-2-, MMP-9- ja MMP-14-aktiviteettia estää bioaktiivisilla CTTHWGFTLC- (CTT1), GRENYHGCTTHWGFTLC- (CTT2) ja GACFSIAHECGA (peptidi G) -peptideillä. Solujen pahanlaatuisuuteen liittyviä ominaisuuksia, koheesio- ja invaasiokykyä, ja peptidien vaikutusta niihin testasimme in vitro Matrigel^®- ja Transwell^®-alustoilla. Antituumori- ja antigelatinaasiominaisuudet varmistettiin in situ ja in vivo -kokein. Eläinmallina käytettiin karsinoomaksenograftia immuunipuutteisilla hiirillä. Karakterisoimme havaitut anti-MMP-14-peptidin ominaisuudet, sekä testasimme sen kykyä estää syöpäsolujen kasvua ja liikettä. Traneksaamihapon ja antigelatinaasin vaikutus proMMP-9-aktivaatioon osoitettiin gelatinolyysillä ja immunoblotting-menetelmällä. Pienimolekyylikirjastojen seulontaan käytettiin apuna bakteriofagikirjastoa. Löydetyn kemikaalin biologista aktiivisuutta testattiin useilla leukemia-solulinjoilla, ja kykyä estää leukosyyttien hakeutumista inflammaatiopaikalle kokeellisella vatsakalvon inflammaatiomallilla sekä lymfooman ja leukemian hiirimalleilla. Arvioidaksemme tuumorin leukosyytti-infiltraation osuutta sen kasvussa, hiiriin injektoitiin myös ?M?2- integriinejä sisältämätön HSC-3 kielisyöpä.

Tulokset

Hydrofobisempi CTT2 oli jonkin verran CTT1:tä tehokkaampi estämään HSC-3- kielisyöpäsolujen invaasiota, ja pystyi tehokkaasti estämään myös gelatinaasien aktiivisuutta ihmisen kielisyöpänäytteissä in situ. Ksenografti-hiirimallilla osoitimme CTT2:n pystyvän merkittävästi estämään kielisyövän kasvua ja tuumorin verisuonimuodostusta. Peptidi-G esti selektiivisesti MMP-14–aktiivisuutta sekä usean syöpäsolutyypin liikkumista in vitro. Pepspot-kalvolla osoitimme sen rengasrakenteella olevan keskeinen merkitys sen aktiivisuudelle. Peptidi G esti kielisyövän kasvua hiirimallissa, mutta ei vaikuttanut kasvainten verisuonenmuodostukseen. Traneksaamihappo ja CTT1 potentoivat toistensa vaikutusta invaasioon, migraatioon, sekä proMMP-9 konversioon in vitro.

Kehittämässämme menetelmässä bakteriofageja koettimena käyttäen identifioidaan pienimolekyylikirjastoa pooleina kiinteän substraatin päällä, jolloin löysimme ?M?2-integriinin aktiiviseen muotoonsa stabiloivan molekyylin joka lisäsi leukosyyttiperäisten solujen adheesiota ja esti migraatiota. Löydetty pienmolekyyli esti tulehdussolujen kerääntymistä peritoniittimallissa, sekä leukemian ja lymfooman kasvua in vivo. Kemikaaliryhmän kielisyöpätuumorien kasvu oli yllättäen vähemmän invasiivinen ja leukosyyttien infiltraatio merkittävästi alentunut.

Johtopäätökset

Tulosten perusteella voidaan tehdä johtopäätös, että bioaktiivisen peptidin hydrofiilisyyden lisääminen voi lisätä sen aktiivisuutta ja että kapeakirjoisilla anti-MMP-peptideillä voidaan estää myös kielisyövän kasvua. Mikäli syöpäpotilaiden yksilöllinen MMP-tuotanto määritetään, voisi peptideillä olla mahdollisesti terapeuttista potentiaalia liitettäessä perinteisiin syöpähoitoihin. Samoin ?M?2-integriinin stabiloiva pienmolekyyli on kandidaatti kehitettäessä hoitoja leukemiaan ja lymfoomaan, sekä inflammatorisiin tiloihin. Koska koejärjestelyt kestivät jopa kaksi kuukautta ja merkittäviä haittavaikutuksia ei ilmennyt, voidaan löydettyä molekyyliä pitää mielenkiintoisena ehdokkaana tulevaisuuden lääkekokeille.

Peptidic matrix metalloproteinase inhibitors and leukocyte ?₂-integrin stabilizing small molecule can inhibit progression of tongue carcinoma

Proteolytic enzymes, such as matrix metalloproteinases (MMP), are associated with the progression of several cancers. Gelatinases (MMP-2 and -9) and membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), in particular, are often associated with more aggressive types of head and neck carcinomas. We have identified synthetic peptide-targeting gelatinases and MT1-MMP, and have also evaluated their anticancer effects in vitro and in vivo.

Antigelatinolytic peptides effectively inhibited invasion of tongue-carcinoma cells and reduced the growth of xenografted tumors. In tumor samples of mice that were treated with antigelatinolytic peptides, the micro-vessel density was significantly reduced. We also identified a novel MT1-MMP targeting peptide and demonstrated that it exerted anticancer effects against several malignant cell lines in vitro and in vivo. The effects of MT1-MMP inhibition on tongue squamous-cell carcinomas were evaluated by using xenograft tumors, which it effectively inhibited.

Leukocyte ?2 integrins are another interesting option when targets for the therapeutic intervention of inflammatory conditions or blood malignancies are evaluated. We identified a novel technique for screening small-molecule libraries against ?2 integrins; and using this technique, we identified a novel ?M?2 integrin-binding chemical. This chemical enhances leukocyte adhesion, inhibits motility, reduces leucocyte tumor infiltration and inhibits tumor invasion.

Osajulkaisut:

I Heikkilä P, Suojanen J, Pirilä E, Väänänen A, Koivunen E, Sorsa T, Salo T. Human tongue carcinoma growth is inhibited by selective antigelatinolytic peptides. Int J Cancer 2006; 118: 2202–9.

II Suojanen J, Salo T, Koivunen E, Sorsa T, Pirilä E. A novel and selective membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) inhibitor reduces cancer cell motility and tumor growth. Cancer Biol Ther 2009; 42 (Epub ahead of print)

III Suojanen J, Sorsa T, Salo T. Tranexamic acid can inhibit tongue squamous cell carcinoma invasion in vitro. Oral Dis 2009; 15: 170–5.

IV Björklund M, Aitio O, Stefanidakis M, Suojanen J, Salo T, Sorsa T, Koivunen E. Stabilization of the activated ?M?2 integrin by a small molecule inhibits leukocyte migration and recruitment. Biochemistry 2006; 45: 2862–71.

V Suojanen J, Salo T, Sorsa T, Koivunen E. ?M?2 integrin modulator exerts antitumor activity in vivo. Anticancer Res 2007; 27: 3775–82.

Julkaisun pysyvä osoite: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-5627-7