Verisuonikasvutekijän (VEGF-A) ja endostatiinin vaikutukset luuhun

Tutkimuksen tausta ja tavoite

Luuston kehitys ja luustovaurioiden korjautuminen ovat riippuvaisia verisuonten muodostumisesta, jota verisuonikasvutekijä (VEGF) olennaisesti säätelee. Endostatiini on kollageeni XVIII:n fragmentti, jonka on osoitettu estävän verisuonikasvua. VEGF:n ja endostatiinin osuudesta luun uusiutumisen säätelyyn tiedetään vähän. Väitöskirjatyössä tutkittiin VEGF:n ja endostatiinin vaikutuksia luusoluihin, sekä näiden kasvutekijöiden mahdollista käyttöä luun muodostumisen säätelyyn. Lisäksi selvitettiin endostatiinin vaikutusta luun kehitykseen.

Menetelmät

VEGF:n vaikutuksia luudefektin paranemiseen ja vaskularisoitumiseen tutkittiin käyttämällä mallia, jossa rotan reisiluiden distaalipäihin tehtiin porausdefektit. Adenovirusvektorilla viedyn VEFG-A:n vaikutusta verisuonten muodostumiseen ja luukudoksen paranemiseen arvioitiin suorittamalla luun tiheysmittaukset pQCT:lla (peripheral quantitative computed tomography). Lisäksi luun paranemista seurattiin histologisesti mittaamalla fibroosin kudoksen ja ruston määrää, sekä tutkimalla muodostuneita verisuonia.

VEGF:n ja endostatiinin suoria vaikutuksia luusoluihin selvitettiin käyttämällä rotan osteoklastien resorptiomallia ja hiiren osteoklastien differentaatiomallia, sekä MC3T3-E1- solulinjan osteoblasteja.

VEGF-A:n ja endostatiinin vaikutuksia luutumisprosessiin tutkittiin ektooppisen luutumisen mallin avulla, jossa poron luusta eristettyä luun morfogeneettistä proteiinia eli BMP:tä käyttäen indusoitiin luutumisprosessi hiiren takajalan lihakseen. VEGF-A:n ja endostatiinin yliekspressio lihaksessa aikaansaatiin adenovirusvektoria apuna käyttäen. Muodostuneen luun määrä mitattiin radiologisesti. Induktion etenemistä seurattiin histologisesti eri aikapisteissä kerätyistä näytteistä.

Lopuksi tutkittiin endostatiinia yliekspressoivista ja endostatiinin suhteen poistogeenisistä hiiristä mahdollisia luustomuutoksia eri aikapisteissä. Hiirten takajalat analysoitiin radiologisesti faksitronin ja pQCT:n avulla sekä tutkimalla niitä histologisesti.

Tulokset

VEGF:n yliekspressiolla havaittiin olevan luun paranemista nopeuttava vaikutus. Sen todettiin merkittävästi lisäävän verisuonten määrää ja nopeuttavan endokondraalista luutumista. Tutkimus osoitti ensimmäistä kertaa, että VEGF-A adenovirus-geenisiirteellä voidaan vaikuttaa luudefektin paranemiseen jyrsijämallissa.

Tutkimuksessa havaittiin endostatiinilla olevan inhiboiva vaikutus VEGF-A:n stimuloimaan osteoklastien resorptioon, mutta yksinään sillä ei ollut vaikutusta luun resorption perustasoon. Lisäksi endostatiini vähensi osteoklastien erilaistumista sekä VEGF-A:n läsnä ollessa että ilman sitä. Endostatiinin havaittiin inhiboivan MC3T3-E1- solulinjan osteoblastien proliferaatiota. Lisäksi endostatiini VEGF-A:n läsnä ollessa vähensi osteoblastien proliferaatiota ja mineralisaatiota.

Ektooppisen luun muodostumisen mallissa havaittiin VEGF-A:n stimuloivan ja endostatiinin vähentävän verisuonten muodostumista, kuten myös rustoa resorboivien kondroklastien ja osteoklastien määrää. Endostatiini yksin tai VEGF:n läsnä ollessa vähensi luun muodostumista.

Endostatiinia yliekspressoivilla ja endostatiinin suhteen poistogeenisillä hiirillä ei havaittu eroja luun tiheydessä tai mineraalipitoisuudessa, mutta luun kehityksessä havaittiin lieviä viiveitä. Endostatiinin yliekspressoituminen hidasti luiden pituuskasvua. Sekundääristen luutumistumakkeiden muodostumisen havaittiin viivästyneen endostatiinin suhteen poistogeenisillä hiirillä. Näiden muutosten havaittiin kuitenkin olevan ohimeneviä. Immunohistokemiallisin värjäyksin kollageeni XVIII paikallistettiin periostin ja luuytimen tyvikalvoihin, sekä lihasten kiinnittymisalueille.

Johtopäätökset

Tutkimus osoitti, että VEGF-geenisiirteellä voidaan nopeuttaa luuvaurion paranemista. Endostatiinin havaittiin yksin tai yhdessä VEGF:n kanssa vähentävän ektooppisen luun muodostumista hidastamalla ruston kehitystä. Soluviljelykokeissa endostatiinin havaittiin vaikuttavan luusolujen käyttäytymiseen, erityisesti sen todettiin vähentävän VEGF:n stimuloimia vaikutuksia. Luun kehitykseen endostatiinilla ei kuitenkaan ole ratkaisevaa merkitystä.

Effects of vascular endothelial growth factor (VEGF-A) and endostatin on bone

Angiogenesis is essential for the replacement of cartilage by bone during skeletal growth and regeneration. Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) is a key regulator of angiogenesis whereas endostatin, a potent inhibitor of endothelial cell proliferation and migration, is a natural antagonist of VEGF-A. The regulatory roles of these peptides in angiogenesis, bone formation and bone cells were investigated in this study.

We studied the effects of VEGF-A, delivered with an adenoviral vector, on the recovery of bone drilling defects in rat femur. Our data confirm the important role of VEGF in bone healing and that adenoviral VEGF gene transfer may modify bone defect healing.

We studied the effects of VEGF-A and endostatin on bone resorption activity. It was found that VEGF-A is a potent stimulator of bone resorption and osteoclast differentiation in vitro and endostatin can antagonize this stimulatory effect when acting directly on bone cells.

The effects of VEGF-A and endostatin in the ectopic bone formation, which share features with bone growth and healing were evaluated. It was found that endostatin retards the cartilage phase in endochondral ossification that subsequently reduces bone formation.

We further investigated the effects of endostatin and VEGF-A on mouse pre-osteoblastic cells. Finally the effects of endostatin on bone were studied in transgenic mouse lines.

Osajulkaisut

I Tarkka T, Sipola A, Jämsä T, Soini Y, Ylä-Herttuala S, Tuukkanen J, Hautala T. Adenoviral VEGF-A gene transfer induces angiogenesis and promotes bone formation in healing osseous tissues. J Gene Med 2003; 5: 560–6.

II Sipola A, Nelo K, Hautala T, Ilvesaro J, Tuukkanen J. Endostatin inhibits VEGF- A induced osteoclastic bone resorption in vitro. BMC Musculoskelet Disord 2006; 13: 56.

III Sipola A, Ilvesaro J, Birr E, Jalovaara P, Petterson RF, Stenbäck F, Ylä-Herttuala S, Hautala T, Tuukkanen J. Endostatin inhibits endochondral ossification. J Gene Med 2007; 9: 1057–64.

IV Sipola A, Seppinen L, Pihlajaniemi T, Tuukkanen J. Endostatin affects osteoblast behavior in vitro, but collagen XVIII/endostatin is not essential for skeletal development in vivo. Calcif Tissue Int 2009; 85: 412–20.

Julkaisun pysyvä osoite: http://herkules.oulu.fi/isbn9789514293184/