Isännän vaste kudostuhon takana

Materiaalit ja menetelmät

Työssä tutkittiin kahden hampaan tukikudoksissa esiintyvän tulehdussairauden, perikoroniitin ja parodontiitin, molekyylibiologista mekanismia. Kudosnäytteistä ja standardoidulla stripsimenetelmällä kerätyistä ientaskunestenäytteistä määritettiin tulehdusreaktion aiheuttamat molekyylibiologiset muutokset.

Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä selvitettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä TNF-α:n ja sen reseptorien ilmenemistä. Kudosnäytteet tutkittiin tsymografia-menetelmällä, jotta pystyttäisiin tutkimaan TNF-α:n tuhoavaa vaikutusta. Kokeessa käytettiin sekä TNF-α:aa stimuloivaa että estävää entsyymiä. Toisessa osatyössä ientaskunesteestä määritettiin MMP-3-, MMP-8- ja MMP-9- molekyylimuodot western blotting -menetelmällä. Ientaskunestenäytteet analysoitiin tsymografia-menetelmällä. Immunohistokemiallisella värjäyksellä määritettiin MMP-3 ienkudoksessa. Kudosviljelyssä analysoitiin TNF-α:n aktivoima MMP-synteesi. Kolmannessa osatyössä ienkudoksen fibroblasteja stimuloitiin sytokiineillä (IL-1 β, TNF-α, tai IL-17), jotta fibroblastit tuottaisivat MMP:tä. Monosyyttejä stimuloitiin sytokiinillä (IL-17), jotta vapautuisi muita sytokiinejä (IL-6 ja IL-8). Lopuksi näytteet analysoitiin ELISA:lla (entsyymi-immunologinen määritys). Neljännessä osatyössä lokalisoitiin immunohistokemiallisella värjäysmenetelmällä reseptoriperheen TLR-1-TLR-10 reseptorit ienkudoksessa. Viimeisessä osatyössä selvitettiin ELISA:lla sytokiinien (IL-1 ja TNF-α) vapautumista epiteelisoluista TLR- ligandeja käyttäen sekä kombinoituna IL-17:n kanssa.

Tulokset ja johtopäätökset

Ensimmäisessä osatyössä havaittiin TNF-reseptoreja viisaudenhampaan kruunua ympäröivässä ienkudoksen tulehduksessa (perikoroniitti). Todettiin myös, että TNF-α:n ligandi-reseptori- interaktion biologisena indikaattorina tutkittujen interleukiini-1β:n ja VCAM-1:n ilmeneminen oli lisääntynyt. Toisessa osatyössä ikenen fibroblasteista vapautui MMP-3:a. Parodontiittia sairastaneiden koehenkilöiden ientaskunesteestä määritettiin osittain aktivoituneet MMP-muodot (MMP-3, MMP-8 ja MMP-9). Tulosten perusteella pro-MMP-3:n tulkittiin erittyvän ikenen fibroblasteista vasta TNF-α-stimulaation jälkeen. Kolmannessa osatyössä osoitettiin IL-17:n ilmeneminen parodontiittisen kudoksen soluissa. IL-17:n havaittiin indusoivan sytokiinien (IL-1β ja TNF-α) vapautumista ja myös MMP-1- ja MMP-3- määrien todettiin kohonneen. Neljännessä osatyössä todettiin, että reseptoriperheen TLR-1-TLR-10 reseptoreiden määrä oli tilastollisesti runsaampi tulehtuneessa kuin terveessä ienkudoksessa. Viimeisen osatyön tutkimus osoitti viljeltyjen epiteelisolujen erittävän sytokiinejä (IL-1β ja TNF-α) TLR-2- ja TLR-5- spesifisten ligandien indusoimina.

Tulokset osoittavat, että kudoksen TLR:ien määrä eroaa parodontaalisesti sairaiden ja terveiden verrokeiden välillä. Ienkudoksen solut reagoivat tulehdukseen TLR-riippuvaisesti tuottamalla pro-inflammatorisia sytokiinejä TNF-α ja IL-1β. Niiden vapautuminen ja yhteistoiminta muiden tulehduksen välittäjäaineiden kanssa voimistaa tulehdusreaktiota. Tämän tulehdusketjun myötä sairaassa parodontiumissa vapautuu myös enemmän MMP:eja (MMP-1, MMP-3, MMP-8 ja MMP-9) terveeseen verrattuna.

Tämä väitöskirjatyö lisää tietoamme parodontiitin avainpatogeeneistä ja luo tarkempaa tietämystä mikrobeiden ja isännän välisestä vuorovaikutuksesta. Tämän tapahtumasarjan syvällinen ymmärtäminen on tärkeää kehitettäessä uusia hoitoja ja diagnostisia menetelmiä. n

Characterization of cytokines, matrix metalloproteinases and toll-like receptors in human periodontal tissue destruction

Periodontal disease affects the supporting structures of the teeth and is initiated by a microbial biofilm. The destruction of tissue is caused by a cascade of microbial and host factors together with proteolytic enzymes. Matrix metalloproteinases (MMPs) are known to be central mediators of the pathologic destruction in periodontitis. Initially, plaque bacteria provide pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which are sensed by Toll-like receptors (TLRs) and initiate intracellular signaling cascades leading to host inflammation.

The aim of this PhD study was to characterize TNF-α and its type I and II receptors in periodontal tissues, as well as the effects of TNF-α, interleukin-1beta (IL-1β) and IL-17 on the production and/or activation of MMP-3, MMP-8 and MMP-9. Furthermore, we mapped TLRs in periodontal tissues and assessed how some of the PAMPs, binding to the key TLRs found in periodontal tissues, affect production of TNF-β and IL-1β by gingival epithelial cells with or without combination of IL-17.

In summary, these results demonstrate that the TLRs present in periodontal tissues and cells of gingival tissues respond to the inflammatory process in a TLR-dependent manner by producing pro-inflammatory cytokines. These, in turn, increase inflammation, thus being more harmful to the host as the presence of MMPs increases at diseased sites compared to healthy ones.

Osajulkaisut

I. Beklen A, Laine M, Ventä I, Hyrkäs T, Konttinen YT. Role of TNF-a and its receptors in pericoronitis. J Dent Res 2005; 84: 1178–82.

II. Beklen A, Tüter G, Sorsa T. Hanemaaijer R, Virtanen I, Tervahartiala T, Konttinen YT. Gingival tissue and crevicular fluid co-operation in adult periodontitis. J Dent Res 2006; 85: 59–63.

III. Beklen A, Ainola M, Hukkanen M, Gürgan C, Sorsa T, Konttinen YT. MMPs, IL-1 and TNF are regulated by IL-17 in periodontitis. J Dent Res2007; 86: 347–51.

IV. Beklen A, Hukkanen M, Richardson R, Konttinen YT. Immunohistochemical localization of Toll-like receptors 1–10 in periodontitis. Oral Microbiol Immunol 2008; 5: 425–431.

V. Beklen A, Sorsa T, Konttinen YT. Toll-like receptors 2 and 5 in human gingival epithelial cells co operate with T-cell cytokine interleukin-17. Oral Microbiol Immunol 2009; 24: 38–42.